高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、通过有限稀释法对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆；步骤二、通过血凝抑制方法检测经亚克隆所得到的不同细胞株的效价，筛选出效价最高的细胞株C68，其保藏编号为：CGMCC No.21903；步骤三、将细胞株C68在生物反应器中进行连续培养或批次培养。本发明专利技术通过对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，筛选出一株能够高效分泌抗体的细胞株，并通过生物反应器进行放大培养，收获的半成品抗体含量高、质量稳定可控，减少了下游浓缩等耗时的步骤。

【技术实现步骤摘要】
高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法
本专利技术属于微生物
，涉及一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及利用生物反应器生产该抗体的方法。
技术介绍
犬细小病毒病（CPVD）是由犬细小病毒引起的一种高度接触性传染病。该病可引起犬的急性肠炎及心肌炎，各年龄段犬均可感染，幼犬更易感染，且病死率高。该病不仅使犬主人经济受到损失同时还给心灵带来创伤，目前该病是养犬业重要的传染病之一。预防犬细小病毒病的方法主要是接种疫苗，对于患病犬的治疗方法主要是给发病早期的犬注射抗犬细小病毒血清或者注射抗犬细小病毒单克隆抗体，同时配合输液及注射犬的免疫球蛋白或者白蛋白等等，可有效降低该病的病死率。目前，治疗犬细小病毒病所用抗CPV免疫血清是由犬或者异源动物所制备，其质量不稳定，生产成本高，并且有携带外源病毒的风险，可引起严重的生物安全问题；而应用单克隆抗体治疗犬细小病毒病，不但能降低上述风险，并且治疗效果更佳，但现有的抗CPV单克隆抗体中和效价（抗病毒活性）低，半成品需要进行多倍浓缩后才能制成品，生产成本高、效率低。
技术实现思路
为了克服犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌抗体水平低、产品质量不稳定、生产效率低、生产成本高等问题，本专利技术提供了一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法。本专利技术通过对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，筛选出一株能够高效分泌抗体的细胞株，并通过生物反应器进行放大培养，收获的半成品抗体含量高、质量稳定可控，减少了下游浓缩等耗时的步骤。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68，其分类命名为杂交瘤细胞（hybridoma），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.21903，保藏日期为2021年2月25日。一种利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，包括如下步骤：步骤一、通过有限稀释法对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆；步骤二、通过血凝抑制方法检测经亚克隆所得到的不同细胞株的效价，筛选出效价最高的细胞株C68，其效价为1:2560；步骤三、将细胞株C68在生物反应器中进行连续培养，培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70rpm，溶氧为40%，pH为6.85，每日收获抗体2L，可连续收获100天以上，收获的抗体效价为1:2560；或者细胞株C68在生物反应器中进行批次培养，批次培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70rpm，溶氧为40%，pH为6.85，在流加第6~7天可全部收获，收获的抗体效价为1:2560。本专利技术中，所述连续培养和批次培养均包括细胞生长阶段（即：培养细胞增殖）和抗体分泌阶段两个阶段，具体培养要求如下：连续培养：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始进行流加培养，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时（多在流加第6~7天达到），开始收获细胞悬液，此时开启反应器的出液管道，将流速设置为每24小时收获2L，同时进行同流速补液，补液的成分为（基础培养基：流加培养基=3:1)；批次培养：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始添加流加培养基，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时（多在流加第6~7天达到），即可全部收获）。相比于现有技术，本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术从建立的130株分泌CPV单克隆抗体杂交瘤细胞株中筛选到一株分泌抗体水平最高的细胞株，命名为C68，该细胞株分泌的抗体经血凝抑制检测，效价可达到1：2560。与现有技术相比，细胞株C68分泌抗体水平更高，减少了下游浓缩的繁杂工艺，提高了产品纯度和稳定性。（2）本专利技术提供了一种对筛选到的细胞株C68在生物反应器中放大培养的方法，该方法在培养过程中不添加血清，避免了异源血清残留带来的负面影响，通过此方法生产的半成品成分明确、质量稳定。本专利技术提供的在生物反应器中培养分为细胞生长和抗体分泌两个阶段，可在反应器中持续分泌抗体100天以上，抗体分泌时间长且分泌抗体水平高是本专利技术的显著优势。（3）与现有技术相比，细胞株C68分泌抗体水平高，在生物反应器中持续分泌时间长，且培养基不含血清，成分安全，产品批间差小，是生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的有效方法。保藏信息：保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称：CGMCC；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；保藏日期：2021年2月25日；保藏编号：CGMCCNo.21903。具体实施方式下面对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。本专利技术提供了一种利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，所述方法包括如下步骤：1、阳性杂交瘤细胞的亚克隆：（1）细胞复苏：取一只犬细小病毒杂交瘤细胞1D3株（北京世纪元亨）进行复苏，用含10%新生牛血清（山西润生大业生物材料有限公司）的DMEM培养基培养，37℃，培养48小时。（2）将复苏的1D3细胞进行亚克隆：对培养48小时后的1D3细胞进行台盼蓝染色计数，通过有限稀释法将细胞稀释成6个/ml后铺96孔板，每孔100μL，置于37℃，含5%CO2的温箱培养2日后，记录下有单细胞生长的孔，待培养7~9日后，将有单细胞生长的孔中的细胞上清液取出，通过血凝抑制试验检测每株单细胞的抗体效价，经过10次的亚克隆筛选鉴定，最终筛选到产抗体水平最高的杂交瘤细胞命名为C68，对细胞株C68进行扩大培养并进行液氮冻存。通过对细胞株C68进行流加培养，其抗体水平可在流加后第五天达到高峰，其抗体血凝抑制效价可达到1：2560。对细胞株C68进行抗体分泌稳定性检测，经试验验证该细胞株在连续传代70次后，其抗体分泌仍稳定不降。每升基础培养基中的成分为：HCl10mmol/L1ml、胰岛素10mg、NaOH0.25g、NaHCO32g、DrinvingMSF200123.91g（上海倍谙基生物科技有限公司）、H2O1000g；每升基础流加培养基的成分为：HCl10mmol/L5ml、NaOH0.4g、NaHCO31.9g、DrinvingMSF2001123.18g（上海倍谙基生物科技有限公司）、H2O1000g。（下文中所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68，保藏编号为：CGMCCNo.21903。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68，保藏编号为：CGMCCNo.21903。


2.一种利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
步骤一、通过有限稀释法对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆；
步骤二、通过血凝抑制方法检测经亚克隆所得到的不同细胞株的效价，筛选出效价最高的细胞株C68；
步骤三、将细胞株C68在生物反应器中进行连续培养或批次培养。


3.根据权利要求2所述的利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，其特征在于所述步骤三中，连续培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70rpm，溶氧为40%，pH为6.85。


4.根据权利要求2所述的利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，其特征在于所述步骤三中，批次培养条件为：温度...

【专利技术属性】
技术研发人员：任德强，张健，宋新刚，叶阳，张立恒，孙博，麻昌姣，朱传海，蒋艳茹，韩雪，
申请(专利权)人：哈尔滨元亨生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23