一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，涉及癫痫治疗研究技术领域。该慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，为研究低频电刺激(LFS)的癫痫治疗机制，本研究拟选用6‑8周龄雄性SD大鼠，构建氯化锂‑匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型，LFS治疗模型大鼠，刺激海马部位，对实验鼠的脑电图及行为学进行监测并记录，应用RT‑PCR、Westernblot方法检测海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关的RhoA、ROCK‑I和ROCK‑II的基因水平、蛋白水平表达变化，并留取海马组织进行并行病理切片及免疫组化，探讨LFS治疗癫痫是否是基于Rho/ROCK信号通路而发挥作用。本发明专利技术通过探讨LFS对癫痫的改善是否是通过Rho/ROCK信号通路而发挥作用为癫痫的防治提供理论依据。

Construction and application of a rat model of chronic epilepsy

【技术实现步骤摘要】
一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途
本专利技术涉及癫痫治疗研究
，具体为一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途。
技术介绍
癫痫(epilepsy)是一种严重的慢性中枢神经系统疾病，是由反复发作、高度同步化的大脑神经元异常放电导致的暂时性大脑功能失调，临床表现为运动、感觉、意识、植物神经和精神等不同障碍，是神经系统比较常见的疾病之一，危害全球超过6500万人口。与癫痫相关的致残、致死及并发症给患者及社会造成了沉重的负担。目前对于癫痫的发生机制所知甚少，不利于癫痫的防治。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，解决了LFS治疗癫痫的机制无理论依据的问题。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，为研究低频电刺激(LFS)的癫痫治疗机制，本研究拟选用6-8周龄雄性SD大鼠，构建氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型，LFS治疗模型大鼠，刺激海马部位，对实验鼠的脑电图及行为学进行监测并记录，应用RT-PCR、Westernblot方法检测海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关的RhoA、ROCK-I和ROCK-II的基因水平、蛋白水平表达变化，并留取海马组织进行并行病理切片及免疫组化，探讨LFS治疗癫痫是否是基于Rho/ROCK信号通路而发挥作用，其主要研究内容如下1.氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型的建立和评价；2.LFS对癫痫大鼠模型海马刺激；3.海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关基因蛋白的检测及机制探讨，需要明确实验鼠海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关的RhoA、ROCK-I和ROCK-II的基因水平、蛋白水平表达的变化，为LFS治疗癫痫的机制研究提供理论依据，成功构建氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型，记录大鼠癫痫发作的情况，并通过脑电图、行为学监测等评估模型鼠的制备。优选的，氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型的建立和评价具体方法为：S1.60只SPF清洁级雄性SD大鼠(200～250g)，1.5mol/L氯化锂腹腔注射，剂量127.17mg/kg,18h后注射0.25mg/ml东莨菪碱，剂量1mg/kg,之后每隔30min注射7.5mg/ml的匹鲁卡品，剂量10mg/kg，重复3-5次；S2.采用Racine评分记录每只大鼠的发作级别,大鼠急性期出现Ⅳ级以上的癫痫发作且经过1周恢复后持续监测大鼠行为学表现,出现静息期癫痫发作的大鼠进行脑电图监测，若出现痫样放电则为慢性癫痫大鼠模型构建成功,对照组于相同时刻注射等量生理盐水。优选的，LFS对癫痫大鼠模型海马刺激按随机数字表法将大鼠分为癫痫组、假刺激组、治疗组和空白对照组，各组大鼠体重差异无统计学意义,Alpha-Lab4通道信号采集及处理系统记录大鼠脑电活动，直到实验结束,癫痫发作30d后用刺激器给大鼠以持续的电刺激，刺激参数：脉冲双向方波，累计时间30min，波宽1ms，强度100μA，频率1Hz，每天固定时间刺激1次，连续2周。优选的，马组织液中Rho/ROCK信号通路相关基因蛋白的检测及机制探讨,具体操作方法如下：1)标本采集及切片：以海马LFS治疗结束为终点，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，一部分用0.9％生理盐水及4％多聚甲醛经左心室灌注后固定取脑，多聚甲醛后固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，行脑冠状石蜡切片，片厚5μm，用于后续尼式染色与免疫组化实验，其余大鼠断头取脑，剥离子迅速剥离右侧海马，液氮中冷冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于后续RT-PCR反应及免疫印迹；2)尼式染色：石蜡切片常规脱蜡脱水，切片经1％甲苯胺蓝65℃浸染30min，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，每次2min，95％乙醇迅速分化，显微镜下观察至背景成淡蓝色；脱水、透明、封片；3)免疫组化：将中性甲醛固定后的孕鼠胎盘组织进行脱水，石蜡包埋后切成厚度为5μm的石蜡切片，进行烤片、脱蜡后用乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液(pH＝8.0)在100℃进行抗原修复2min，用山羊血清封闭30min。切片滴加Rheb抗体(1:500)后于湿盒中4℃孵育过夜，生物素标记的二抗室温孵育30min，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)润洗后，用二氨基联苯胺(DAB)进行显色，显微镜下严格控制显色时间，复染细胞核后用中性树胶封片，每个样品随机选取5个高倍视野(×400)再进行半定量分析，目的蛋白的阳性表达呈棕黄色，其表达水平用平均吸光度值表示；分别得出5个高倍视野的积分吸光度值与面积，平均吸光度值＝积分吸光度值/面积，以每个样本5个视野的平均吸光度值的均值作为每个样本的目的蛋白的表达水平；4)RT-PCR检测RhoA、ROCK-I和ROCK-II的表达变化：TRIzol试剂提取孕总RNA，总RNA浓度用微量分光光度计测定，取500ng的RNA用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，使用荧光定量检测试剂盒，实时定量PCR系统，PCR反应体系为20μl，以β肌动蛋白基因为参照，代入公式2-△△Ct其中Ct值为循环域值，计算即得mRNA的表达水平，实验重复3次；5)蛋白印迹法检测RhoA、ROCK-I和ROCK-II蛋白的表达水平用已加入蛋白酶抑制剂的裂解液提取孕鼠和胎盘组织的总蛋白，采用二辛可宁酸(BCA)法测定蛋白的浓度后，加入上样缓冲液，煮沸5min使蛋白充分变性，取50μg蛋白加样于8％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后转于硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入目的蛋白单克隆抗体及β-肌动蛋白单克隆抗体，放于抗体孵育盒于4℃摇床过夜；次日用含0.05％吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBST)洗膜后，加入荧光标记的羊抗兔二抗，室温孵育1.5h后洗膜，用双色红外荧光扫描系统进行扫描，用软件进行条带灰度值的分析，以目的蛋白与β-肌动蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平，实验重复3次；6)统计学分析：应用统计软件，数据用珋平均值±标准差表示，数据采用单因素方差分析，方差齐性检验后组间差异统计学意义比较采用LSD-t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。(三)有益效果本专利技术提供了一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途。具备以下有益效果：本专利技术首次对LFS治疗癫痫的作用机制进行多方面通路的探究，通过建立癫痫大鼠模型，观察LFS对癫痫的改善作用，并进一步研究海马组织中RhoA、ROCK-I和ROCK-II蛋白的表达改变，探讨LFS对癫痫的改善是否是通过Rho/ROCK信号通路而发挥作用为癫痫的防治提供理论依据。附图说明图1为本专利技术技术路线图；图2为本专利技术中Racine分级标准图；图3为本专利技术Rho/ROCK信号通路作用示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，其特征在于：为研究低频电刺激(LFS)的癫痫治疗机制，本研究拟选用6-8周龄雄性SD大鼠，构建氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型，LFS治疗模型大鼠，刺激海马部位，对实验鼠的脑电图及行为学进行监测并记录，应用RT-PCR、Westernblot方法检测海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关的RhoA、ROCK-I和ROCK-II的基因水平、蛋白水平表达变化，并留取海马组织进行并行病理切片及免疫组化，探讨LFS治疗癫痫是否是基于Rho/ROCK信号通路而发挥作用，其主要研究内容如下1.氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型的建立和评价；2.LFS对癫痫大鼠模型海马刺激；3.海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关基因蛋白的检测及机制探讨，需要明确实验鼠海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关的RhoA、ROCK-I和ROCK-II的基因水平、蛋白水平表达的变化，为LFS治疗癫痫的机制研究提供理论依据，成功构建氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型，记录大鼠癫痫发作的情况，并通过脑电图、行为学监测等评估模型鼠的制备。/n

【技术特征摘要】
1.一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，其特征在于：为研究低频电刺激(LFS)的癫痫治疗机制，本研究拟选用6-8周龄雄性SD大鼠，构建氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型，LFS治疗模型大鼠，刺激海马部位，对实验鼠的脑电图及行为学进行监测并记录，应用RT-PCR、Westernblot方法检测海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关的RhoA、ROCK-I和ROCK-II的基因水平、蛋白水平表达变化，并留取海马组织进行并行病理切片及免疫组化，探讨LFS治疗癫痫是否是基于Rho/ROCK信号通路而发挥作用，其主要研究内容如下1.氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型的建立和评价；2.LFS对癫痫大鼠模型海马刺激；3.海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关基因蛋白的检测及机制探讨，需要明确实验鼠海马组织液中Rho/ROCK信号通路相关的RhoA、ROCK-I和ROCK-II的基因水平、蛋白水平表达的变化，为LFS治疗癫痫的机制研究提供理论依据，成功构建氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型，记录大鼠癫痫发作的情况，并通过脑电图、行为学监测等评估模型鼠的制备。


2.根据权利要求1所述的一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，其特征在于：氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠模型的建立和评价具体方法为：
S1.60只SPF清洁级雄性SD大鼠(200～250g)，1.5mol/L氯化锂腹腔注射，剂量127.17mg/kg,18h后注射0.25mg/ml东莨菪碱，剂量1mg/kg,之后每隔30min注射7.5mg/ml的匹鲁卡品，剂量10mg/kg，重复3-5次；
S2.采用Racine评分记录每只大鼠的发作级别,大鼠急性期出现Ⅳ级以上的癫痫发作且经过1周恢复后持续监测大鼠行为学表现,出现静息期癫痫发作的大鼠进行脑电图监测，若出现痫样放电则为慢性癫痫大鼠模型构建成功,对照组于相同时刻注射等量生理盐水。


3.根据权利要求1所述的一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，其特征在于：LFS对癫痫大鼠模型海马刺激按随机数字表法将大鼠分为癫痫组、假刺激组、治疗组和空白对照组，各组大鼠体重差异无统计学意义,Alpha-Lab4通道信号采集及处理系统记录大鼠脑电活动，直到实验结束,癫痫发作30d后用刺激器给大鼠以持续的电刺激，刺激参数：脉冲双向方波，累计时间30min，波宽1ms，强度100μA，频率1Hz，每天固定时间刺激1次，连续2周。


4.根据权利要求1所述的一种慢性癫痫大鼠模型的构建及其用途，其特征在于：马组织液中Rho/ROCK信号通路相关基因蛋白的检测及机制探讨,具体操作方法如下：
1)标本采集及切片：以海马LFS治疗结束为终点，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，一部分用0.9％生理盐水及4％多聚甲醛经左心室灌注后固定取脑，多聚甲醛后固定，乙醇梯度脱水，石蜡包...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢军，彭琼，李振光，刘坤，朱勇，匡卫平，黄亚辉，邓兰秋子，尹佃敏，周惠彧，
申请(专利权)人：湖南省脑科医院湖南省第二人民医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43