对多核苷酸进行测序的方法技术

本发明专利技术提供了一种对多核苷酸进行测序的方法，其中通过相同的发光信号检测不同核苷酸的依次掺入，从而实现多核苷酸序列的测定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对多核苷酸进行测序的方法专利
本专利技术涉及对多核苷酸进行测序的方法，其中通过相同的发光信号检测不同核苷酸的依次掺入，从而实现多核苷酸序列的测定。专利技术背景1977年，桑格专利技术了双脱氧末端终止测序法，成为第一代测序技术的代表。2001年，依托第一代测序技术，完成了人类基因组草图。桑格测序法具有实验操作简单、结果直观准确和实验周期短等特点，在对检测结果时效性要求较高的临床基因突变检测以及基因分型等领域有着广泛的应用。然而，桑格测序法通量小、成本高，限制了其在大规模基因测序中的应用。为克服桑格测序法的缺点，第二代测序技术应运而生。与第一代测序技术相比，第二代测序技术具有通量大、成本低、自动化程度高等优点，适合于大规模测序。目前已开发的第二代测序技术主要涉及边连接边测序(sequencingbyligation,SBL)技术和边合成边测序(sequencingbysynthesis,SBS)技术。这些测序技术的典型实例包括Roche454测序法、AppliedBiosystems公司开发的SOLiD测序法、CompleteGenomics自主开发的联合探针锚定连接法(cPAL)和华大基因开发的联合探针锚定合成法(cPAS)、Illumina公司和Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序法等等。测序检测方法主要有电化学法、光信号检测法等，其中，较为主流的检测方法为光信号检测。为了实现4种碱基(A、T/U、C和G)的鉴别和区分，需要使用4种荧光染料来分别标记4种碱基。目前也有报道使用2种荧光染料标记4种碱基，通过2种荧光染料的不同组合来实现4种碱基的鉴别和区分。而Roche454测序法运用自发荧光原理，将dNTP合成到待测序列产生的焦磷酸转变为ATP，利用生成的ATP和荧光素酶共同氧化荧光素产生荧光，通过检测荧光信号的有无及强弱，区分4种碱基及合成碱基的个数。第二代测序技术由于硬件要求，仪器普遍较为庞大，不利于携带及搬运。目前测序技术已发展至第三代，其克服了第二代测序技术仪器庞大的缺点，如OxfordNanopore的测序仪因为其测序原理的不同使其测序仪体积大大缩小，甚至可以被携带至太空进行测序实验。但是目前第三代测序技术错误率较高，限制了其大规模推广。以Illumina、CompleteGenomics和华大基因开发的测序仪为例，用4种荧光染料分别标记4种碱基，通过激光激发，采集不同的荧光信号，以区分不同碱基。参见例如SaraGoodwin,JohnD.McPhersonandW.RichardMcCombie,Comingofage:tenyearsofnext-generationsequencingtechnologies.Naturereviews,2016,17:333-351c。Illumina公司开发的NextSeq测序系统和Mini-Seq测序系统，以及华大基因BGISEQ-50测序系统均使用2种荧光染料标记4种碱基，通过2种荧光染料的不同组合来实现4种碱基的鉴别和区分。如，通过用第一荧光染料标记碱基A，用第二荧光染料标记碱基G，用第一和第二荧光染料同时标记碱基C，且不对碱基T进行标记，从而区分四种碱基。参见例如美国专利US9453258B2。在Roche454测序法中，依次分别通入一种脱氧核糖核苷酸(dNTP)，若该dNTP能与待测序列配对，则在dNTP合成后释放焦磷酸，焦磷酸与测序反应体系中的ATP硫酸化酶反应生成ATP，生成的ATP再与体系中的荧光素酶共同氧化荧光素发出荧光，荧光信号被检测器捕捉，经计算机分析转换为测序结果。参见例如MartinKircherandJanetKelso.High-throughputDNAsequencing–conceptsandlimitations.Bioessays,2010,32:524-536。Iontorrent测序系统与Roche454测序法类似，依次分别通入一种脱氧核糖核苷酸(dNTP)，若该dNTP能与待测序列配对，则在dNTP合成后释放氢离子，产生的氢离子改变反应体系的pH值，集成在测序芯片上的电器元件将pH值变化转变为电信号传输至计算机，经计算机分析转换为测序结果。参见例如SaraGoodwin,JohnD.McPhersonandW.RichardMcCombie,Comingofage:tenyearsofnext-generationsequencingtechnologies.Naturereviews,2016,17:333-351。这些技术存在以下缺陷：1.利用4种荧光染料标记4种碱基，为了区分不同的荧光信号，测序设备至少配备2种单色激发光源和2个相机，这导致测序装置的制造成本昂贵且体积巨大。2.利用2种荧光染料标记4种碱基，相比于利用4种荧光染料标记，虽然降低了设备制造成本，缩小了设备体积，但是实验证明，由于该方案中其中一种dNTP同时标记了两种荧光，激光同时激发两种荧光发光，随着测序长度增加，模板状态变差(目前存在的二代测序技术，无论何种原理，都存在随着测序读长增加，测序质量变差的情况)，导致标记的两种荧光不能被平衡激发(其中一种荧光发光强度明显高于另一种)使这种融合荧光的dNTP信号趋向于和单种荧光标记的dNTP信号揉合，导致无法区分不同的dNTP，因此其测序质量明显低于用4种荧光染料标记的检测方法。3.不论是利用4种或者2种荧光染料标记4种碱基的检测方法，不同荧光之间均可能存在信号互相干扰，影响测序质量。4.Roche测序法与Iontorrent测序法，虽然不需要激发光源与相机等设备，但是其使用的脱氧核糖核苷酸为天然状态，当遇到待测序列具有重复的碱基排布时，如5’-ATTTG-3’，与碱基排布为5’-ATG-3’的序列相比，只能通过信号强弱进行区分(理论上序列5’-ATTTG-3’信号值约为5’-ATG-3’的3倍)，这种判别方法受测序条件干扰较大，也不易控制，尤其在读长较长时，很难将两者区分开。因此，本领域仍然存在对成本更低、效果更好的测序方法的需要。
技术实现思路
本专利技术涉及对多核苷酸进行测序的方法，其中通过相同的发光信号检测不同核苷酸的依次掺入，从而实现多核苷酸序列的测定。在一个方面，本专利技术涉及用于确定靶多核苷酸的序列的方法，其包括：(a)提供靶多核苷酸，(b)使所述靶多核苷酸与引物接触，以使所述引物杂交至所述靶多核苷酸，从而形成靶多核苷酸与引物的部分双链体，(c)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使所述部分双链体与聚合酶和核苷酸接触，以使得所述核苷酸掺入到所述引物上，其中所述核苷酸选自以下的一种或多种：第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，其中所述第一核苷酸包含经第一标记物标记的第一核苷酸和任选未经标记的第一核苷酸，所述第二核苷酸包含经第二标记物标记的第二核苷酸和任选未经标记的第二核苷酸，所述第三核苷酸选自：(1)经第一标记物标记的第三核苷酸和经第二标记物标记的第三核苷酸，或(2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于确定靶多核苷酸的序列的方法，其包括/n(a)提供靶多核苷酸，/n(b)使所述靶多核苷酸与引物接触，以使所述引物杂交至所述靶多核苷酸，从而形成靶多核苷酸与引物的部分双链体，/n(c)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使所述部分双链体与聚合酶和核苷酸接触，以使得所述核苷酸掺入到所述引物上，/n其中所述核苷酸选自以下的一种或多种：第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，其中所述第一核苷酸包含经第一标记物标记的第一核苷酸和任选未经标记的第一核苷酸，所述第二核苷酸包含经第二标记物标记的第二核苷酸和任选未经标记的第二核苷酸，所述第三核苷酸选自：(1)经第一标记物标记的第三核苷酸和经第二标记物标记的第三核苷酸，或(2)经第一标记物和第二标记物同时标记的第三核苷酸；所述第四核苷酸包含未经标记的第四核苷酸；/n其中所述核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含通过2’或3’氧原子附接的保护基团，/n(d)检测步骤(c)的所述部分双链体上第一标记物的存在，/n(e)检测步骤(c)的所述部分双链体上第二标记物的存在，/n(f)任选地去除在步骤(c)的所述部分双链体中掺入的核苷酸上的保护基团和标记物，/n(g)任选地重复步骤(c)-(f)一次或多次，从而获得所述靶多核苷酸的序列信息，/n其中所述第一标记物和所述第二标记物的存在通过相同的发光信号来检测。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种用于确定靶多核苷酸的序列的方法，其包括
(a)提供靶多核苷酸，
(b)使所述靶多核苷酸与引物接触，以使所述引物杂交至所述靶多核苷酸，从而形成靶多核苷酸与引物的部分双链体，
(c)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使所述部分双链体与聚合酶和核苷酸接触，以使得所述核苷酸掺入到所述引物上，
其中所述核苷酸选自以下的一种或多种：第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸，其中所述第一核苷酸包含经第一标记物标记的第一核苷酸和任选未经标记的第一核苷酸，所述第二核苷酸包含经第二标记物标记的第二核苷酸和任选未经标记的第二核苷酸，所述第三核苷酸选自：(1)经第一标记物标记的第三核苷酸和经第二标记物标记的第三核苷酸，或(2)经第一标记物和第二标记物同时标记的第三核苷酸；所述第四核苷酸包含未经标记的第四核苷酸；
其中所述核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含通过2’或3’氧原子附接的保护基团，
(d)检测步骤(c)的所述部分双链体上第一标记物的存在，
(e)检测步骤(c)的所述部分双链体上第二标记物的存在，
(f)任选地去除在步骤(c)的所述部分双链体中掺入的核苷酸上的保护基团和标记物，
(g)任选地重复步骤(c)-(f)一次或多次，从而获得所述靶多核苷酸的序列信息，
其中所述第一标记物和所述第二标记物的存在通过相同的发光信号来检测。


权利要求1的方法，其中所述第一标记物是发光标记物。


权利要求1的方法，其中步骤(d)包括使步骤(c)的所述部分双链体与特异性结合所述第一标记物的经发光标记物标记的配体接触，随后检测所述部分双链体上所述发光标记物的存在，
任选地，在去除步骤(c)的所述部分双链体中掺入的核苷酸上的保护基团和标记物时一起去除所述配体。


权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤(e)包括使步骤(c)的所述部分双链体与特异性结合所述第二标记物的经发光标记物标记的配体接触，随后检测所述部分双链体上所述发光标记物的存在，
例如，步骤(e)在步骤(d)之后进行。


权利要求2-4中任一项的方法，其中所述发光标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵杰，廖莎，章文蔚，陈奥，徐崇钧，傅德丰，
申请(专利权)人：深圳华大智造极创科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44