【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗药性免疫细胞及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2018年5月17日提交的美国临时申请号62/672,868的优先权，通过引用其所示全部内容纳入本文。背景调节T细胞(Treg)对于维持免疫细胞稳态至关重要，这已通过遗传或物理消融Treg群的灾难性后果得到证明。具体而言，Treg细胞通过对其他免疫细胞实施显性负调控来维持免疫系统的秩序。大致分为天然或适应性(诱导)Treg；天然Treg是CD4+CD25+T细胞，它们发育并从胸腺移出，以在免疫稳态中发挥其关键作用。适应性Treg是非调节CD4+T细胞，其获得了胸腺外的CD25(IL-2Rα)表达，并且通常由炎症和疾病过程如自身免疫和癌症诱导。调节T细胞(Treg)抑制旺盛的免疫系统激活并促进免疫耐受性。因为Treg调节先天和适应性免疫，所以最近对使用Treg进行免疫治疗有非常强烈的兴趣。需要临床耐受以改善结果的疾病(自身免疫性疾病、实体器官移植和造血干细胞移植)可能会受益于Treg免疫疗法。临床上可行的Treg免疫疗法的障碍包括Treg稳定性、脱细胞(off-cell)作用以及证明细胞制备纯度和效力。涉及Treg过继转移以治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)的临床试验初步证明了Treg免疫疗法在人体中的安全性和功效。在这些试验中，已经发现Treg在GVHD患者的血液中持续不超过两周。因此，本领域需要开发这样的免疫细胞，其克服了诸如短持久性的障碍。具体地，本领域需要开发体内持久性增加的Treg。概述类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂在治疗移植物...
【技术保护点】
1.一种类固醇抗性CRISPR修饰的细胞，其包含：/n编码NR3C1的基因座中的遗传修饰，其中所述修饰能够下调NR3C1的基因表达，其中所述修饰位于NR3C1的外显子、剪接供体或剪接受体中，并且其中所述修饰的细胞具有因所述遗传修饰所致的类固醇抗性。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180517 US 62/672,8681.一种类固醇抗性CRISPR修饰的细胞，其包含：
编码NR3C1的基因座中的遗传修饰，其中所述修饰能够下调NR3C1的基因表达，其中所述修饰位于NR3C1的外显子、剪接供体或剪接受体中，并且其中所述修饰的细胞具有因所述遗传修饰所致的类固醇抗性。
2.如权利要求1所述修饰的细胞，其中，所述细胞是多潜能干细胞、造血前体细胞或造血细胞。
3.如权利要求1-2中任一项所述修饰的细胞，其中，所述遗传修饰通过CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统、Cas9直向同源物、Cas9旁系同源物、Cas相关家族成员、锌指、TALEN或大范围核酸酶介导。
4.如权利要求1所述修饰的细胞，其中，所述修饰是插入缺失。
5.如权利要求4所述修饰的细胞，其中，所述插入缺失位于NR3C1的外显子2中。
6.如权利要求4-5中任一项所述修饰的细胞，其中，NR3C1中的所述插入缺失通过CRISPR系统介导。
7.如权利要求3或6所述修饰的细胞，其中，所述CRISPR系统包含CRISPR核酸酶和向导RNA。
8.如权利要求7所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含与NR3C1外显子2中靶序列足够互补的向导序列。
9.如权利要求7所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含SEQIDNO：7-10中任一项所示的核酸序列。
10.如权利要求7所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含SEQIDNO：8中所示的核酸序列。
11.如权利要求1所述修饰的细胞，其中，所述修饰是碱基对取代。
12.如权利要求11所述修饰的细胞，其中，NR3C1中的所述取代通过CRISPR系统介导。
13.如权利要求11-12中任一项所述修饰的细胞，其中，所述CRISPR系统包含碱基编辑器和向导RNA。
14.如权利要求13所述修饰的细胞，其中，所述碱基编辑器包含CRISPR失活或切口DNA结合结构域或其变体，和碱基编辑结构域。
15.如权利要求14所述修饰的细胞，其中，所述CRISPR失活或切口DNA结合结构域是Cas9结构域。
16.如权利要求14所述修饰的细胞，其中，所述CRISPR失活或切口DNA结合结构域是变体Cas9结构域。
17.如权利要求16所述修饰的细胞，其中，所述变体Cas结构域是核酸酶失活Cas9结构域。
18.如权利要求14-17中任一项所述修饰的细胞，其中，所述碱基编辑结构域是脱氨酶结构域。
19.如权利要求18所述修饰的细胞，其中，所述脱氨酶结构域对胞嘧啶或腺嘌呤具有特异性。
20.如权利要求18所述修饰的细胞，其中，所述脱氨酶结构域是胞苷或腺苷脱氨酶。
21.如权利要求11-20中任一项所述修饰的细胞，其中，所述取代将提早终止密码子引入NR3C1中，从而导致NR3C1的基因表达下调。
22.如权利要求13-21中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含与NR3C1外显子中靶序列足够互补的向导序列。
23.如权利要求13-21中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含与NR3C1外显子2中靶序列足够互补的向导序列。
24.如权利要求13-23中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含SEQIDNO：17-54中任一项所示的核酸序列。
25.如权利要求14-20中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含与靶序列足够互补的向导序列，所述靶序列包含NR3C1的剪接受体或剪接供体。
26.如权利要求25所述修饰的细胞，其中，所述取代能够破坏NR3C1mRNA的剪接，从而导致NR3C1的基因表达下调。
27.如权利要求25所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含SEQIDNO：55或56中任一项所示的核酸序列。
28.如前述权利要求中任一项所述修饰的细胞，其中，所述修饰的细胞对皮质类固醇具有抗性。
29.如前述权利要求中任一项所述修饰的细胞，其中，所述修饰的细胞对糖皮质类固醇具有抗性。
30.如权利要求29所述修饰的细胞，其中，所述糖皮质类固醇选自下组：孕酮型糖皮质类固醇、氢化可的松型糖皮质类固醇、美沙酮型糖皮质类固醇和丙酮化合物型糖皮质类固醇。
31.如权利要求29所述修饰的细胞，其中，所述糖皮质类固醇选自下组：地塞米松、倍他米松、氢化可的松(皮质醇)、泼尼松、泼尼松龙、氯替泼诺、地夫可特、甲基泼尼松龙、曲安西龙、氟氢可的松和脱氧皮质酮。
32.一种钙依赖磷酸酶抑制剂(CNI)抗性、遗传修饰的细胞，其包含所述细胞基因组中的外源性钙依赖磷酸酶抑制剂(CNI)抗性基因，其中所述CNI抗性基因因CRISPR介导的同源性定向修复(HDR)插入，并且其中所述修饰的细胞具有因所述抗性基因所致的CNI抗性。
33.如权利要求32所述修饰的细胞，其中，所述细胞是多潜能干细胞、造血前体细胞或造血细胞。
34.如权利要求32所述修饰的细胞，其中，所述遗传修饰通过CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统、Cas9直向同源物、Cas9旁系同源物、Cas相关家族成员、锌指、TALEN或大范围核酸酶介导。
35.如权利要求32所述修饰的细胞，其中，所述钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因插入编码NR3C1的基因座。
36.如权利要求32-35中任一项所述修饰的细胞，其中，所述钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因是钙依赖磷酸酶A(CNa)基因的突变形式或钙依赖磷酸酶B(CNb)基因的突变形式，所述CNa基因选自PPP3Ca、PPP3Cb和PPP3Cc，所述CNb基因选自PPP3R1和PPP3R2。
37.如权利要求36所述修饰的细胞，其中，突变型钙依赖磷酸酶基因使用外源性供体DNA序列通过同源重组插入NR3C1基因座中。
38.如权利要求37所述修饰的细胞，其中，所述外源性供体DNA序列包含SEQIDNO：11中所示的核酸序列。
39.如权利要求32-38中任一项所述修饰的细胞，其中，所述钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因编码钙依赖磷酸酶变体蛋白。
40.如权利要求39所述修饰的细胞，其中，所述钙依赖磷酸酶变体蛋白选自下组：CNa12、CNa22和CNb30。
41.如权利要求39所述修饰的细胞，其中，所述钙依赖磷酸酶变体包含SEQIDNO：3-5中任一项所示的氨基酸序列。
42.如权利要求39-41中任一项所述修饰的细胞，其中，所述钙依赖磷酸酶变体蛋白结合钙依赖磷酸酶抑制剂而非钙依赖磷酸酶，从而隔离所述钙依赖磷酸酶抑制剂并防止钙依赖磷酸酶抑制。
43.如权利要求32-42中任一项所述修饰的细胞，其中，所述修饰的细胞对选自下组的钙依赖磷酸酶抑制剂具有抗性：环孢菌素A(CsA)，伏孢素，他克莫司(FK-506，藤霉素)，吡美莫司及其衍生物和类似物。
44.一种遗传修饰的类固醇抗性和钙依赖磷酸酶抑制剂(CNI)抗性细胞，其包含(1)第一遗传修饰，其包含编码NR3C1的基因座中的插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，和(2)第二遗传修饰，其包含插入所述细胞基因组中的外源性CNI抗性基因，其中所述CNI抗性基因位于所述编码NR3C1的基因座中插入缺失的位点，其中所述修饰的细胞具有因所述遗传修饰所致的类固醇和CNI抗性。
45.如权利要求44所述修饰的细胞，其中，所述细胞是多潜能干细胞、造血前体细胞或造血细胞。
46.如权利要求44所述修饰的细胞，其中，所述基因座对应NR3C1的外显子2。
47.如权利要求44-46中任一项所述修饰的细胞，其中，所述插入缺失通过包含向导RNA的CRISPR系统介导，所述向导RNA包含SEQIDNO：7-10中任一项所示的核酸序列。
48.如权利要求44-47中任一项所述修饰的细胞，其中，所述插入缺失通过包含向导RNA的CRISPR系统介导，所述向导RNA包含SEQIDNO：8中所示的核酸序列。
49.一种遗传修饰的类固醇抗性和钙依赖磷酸酶抑制剂(CNI)抗性细胞，其包含(1)第一遗传修饰，其包含NR3C1基因座中的修饰，其中所述修饰能够下调NR3C1的基因表达，和(2)第二遗传修饰，其包含插入所述细胞基因组中的外源性CNI抗性基因，其中所述修饰的细胞具有因所述遗传修饰所致的类固醇和CNI抗性。
50.如权利要求49所述修饰的细胞，其中，所述细胞是多潜能干细胞、造血前体细胞或造血细胞。
51.如权利要求49所述修饰的细胞，其中，所述第一或第二修饰通过CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统、Cas9直向同源物、Cas9旁系同源物、Cas相关家族成员、锌指、TALEN或大范围核酸酶介导。
52.如权利要求49所述修饰的细胞，其中，所述修饰是插入缺失。
53.如权利要求52所述修饰的细胞，其中，所述插入缺失位于NR3C1的外显子2中。
54.如权利要求52-54中任一项所述修饰的细胞，其中，NR3C1中的所述插入缺失通过CRISPR系统介导。
55.如权利要求54所述修饰的细胞，其中，所述CRISPR系统包含CRISPR核酸酶和向导RNA。
56.如权利要求55所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含与NR3C1外显子2中靶序列足够互补的向导序列。
57.如权利要求55-56中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含SEQIDNO：7-10中任一项所示的核酸序列。
58.如权利要求55-57中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含SEQIDNO：8中所示的核酸序列。
59.如权利要求49所述修饰的细胞，其中，所述修饰是碱基对取代。
60.如权利要求59所述修饰的细胞，其中，NR3C1中的所述取代通过CRISPR系统介导。
61.如权利要求60所述修饰的细胞，其中，所述CRISPR系统包含碱基编辑器和向导RNA。
62.如权利要求61所述修饰的细胞，其中，所述碱基编辑器包含CRISPR失活或切口DNA结合结构域或其变体，和碱基编辑结构域。
63.如权利要求62所述修饰的细胞，其中，所述CRISPR失活或切口DNA结合结构域是Cas9结构域。
64.如权利要求62所述修饰的细胞，其中，所述CRISPR失活或切口DNA结合结构域是变体Cas9结构域。
65.如权利要求64所述修饰的细胞，其中，所述变体Cas9结构域是核酸酶失活Cas9结构域。
66.如权利要求62-65中任一项所述修饰的细胞，其中，所述碱基编辑结构域是脱氨酶结构域。
67.如权利要求66所述修饰的细胞，其中，所述脱氨酶结构域对胞嘧啶或腺嘌呤具有特异性。
68.如权利要求66所述修饰的细胞，其中，所述脱氨酶结构域是胞苷或腺苷脱氨酶。
69.如权利要求59-68中任一项所述修饰的细胞，其中，所述取代将提早终止密码子引入NR3C1中，从而导致NR3C1的基因表达下调。
70.如权利要求61-69中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含与NR3C1外显子中靶序列足够互补的向导序列。
71.如权利要求61-70中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含与NR3C1外显子2中靶序列足够互补的向导序列。
72.如权利要求61-70中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含SEQIDNO：17-54中任一项所示的核酸序列。
73.如权利要求61-68中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含与靶序列足够互补的向导序列，所述靶序列包含NR3C1的剪接受体或剪接供体。
74.如权利要求73所述修饰的细胞，其中，所述取代能够破坏NR3C1mRNA的剪接，从而导致NR3C1的基因表达下调。
75.如权利要求73-74中任一项所述修饰的细胞，其中，所述向导RNA包含SEQIDNO：55-56中任一项所示的核酸序列。
76.如权利要求49-75中任一项所述修饰的细胞，其中，所述修饰的细胞对皮质类固醇具有抗性。
77.如权利要求49-76中任一项所述修饰的细胞，其中，所述修饰的细胞对糖皮质类固醇具有抗性。
78.如权利要求77所述修饰的细胞，其中，所述糖皮质类固醇选自下组：孕酮型糖皮质类固醇、氢化可的松型糖皮质类固醇、美沙酮型糖皮质类固醇和丙酮化合物型糖皮质类固醇。
79.如权利要求77所述修饰的细胞，其中，所述糖皮质类固醇选自下组：地塞米松、倍他米松、氢化可的松(皮质醇)、泼尼松、泼尼松龙、氯替泼诺、地夫可特、甲基泼尼松龙、曲安西龙、氟氢可的松和脱氧皮质酮。
80.如权利要求49-79中任一项所述修饰的细胞，其中，所述钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因是钙依赖磷酸酶A(CNa)基因的突变形式或钙依赖磷酸酶B(CNb)基因的突变形式，所述CNa基因选自PPP3Ca、PPP3Cb和PPP3Cc，所述CNb基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·奥斯本，K·L·西朋，B·R·布拉泽，
申请(专利权)人：明尼苏达大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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