基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，属于微生物检测技术领域。所述病原微生物检测引物组包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n‑1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56。本发明专利技术还公开了包含所述引物组的病原微生物检测试剂盒，以及利用引物组或试剂盒对病原微生物检测的多重PCR扩增方法。利用本发明专利技术检测病原微生物，具有病原覆盖全面、灵敏度高、检测通量高、成本低等优势，能够辅助临床精准识别常见病原体，涵盖细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒、寄生虫、支原体衣原体等，具有重要的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于微生物检测
，具体地，涉及基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
我国目前感染性疾病诊断水平亟待提升，2017年统计数据显示，我国传染性疾病发病率和死亡率分别为509.54(1/10万)和1.43(1/10万)，依然保持上升趋势。相对于全球而言，我国的感染性疾病诊疗水平偏低，HIV、TB患病率和死亡率分别为3.6(1/10万)和0.76(1/10万)，与发达国家差距较大。在我国每年感染性疾病患者中，超过3亿的患者需使用病原检测手段检查进一步辅助诊断，其中危重感染病人人数超1000万人，比如重症肺炎发病人数每年约400万，脓毒血症约560万，新发脑膜炎约85万。针对这些感染类型较为复杂的危重感染病例，目前常规检测手段的无法满足治疗需求。除此之外，新发现病原微生物，以及耐药性不断增强甚至出现多重耐药的病菌涌现，使得临床医生的经验性治疗或常规治疗时常会出现无效的现象。因此，快速明确病原体是有效控制感染的基础。如SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒、寨卡病毒及埃博拉病毒感染等、这类疾病的传染性极强，可能会造成世界性大流行，因此对此类病原体快速、准确地检测为新型诊断技术创造了巨大的市场。据统计，2017年全球微生物诊断行业市场规模为161.6亿美元，增速为4.75％，我国仅为14亿美元左右，增速低于2％，未来发展空间巨大。传统的病原微生物鉴定技术主要分为两类：基于培养的方法例如形态学观察、细胞生理生化特征、细菌培养分型、基因芯片、自动化微生物分析系统等；基于特异引物/探针/抗体的方法例如抗原抗体反应、PCR反应检测以及各种特异性的病原微生物快速检测系统等。这些技术在日常病原微生物确证中发挥了重要作用，但也存在一定的不足：前者需要依赖培养、周期长、鉴定精度低；后者需要一定的微生物序列先验知识、无法实现高通量检测等。基于宏基因组二代测序的病原微生物检测(mNGS)，是一种不依赖培养，借助二代测序平台快速测序直接从环境/临床样品中提取全部微生物的核酸序列，进一步与各个物种的基因组序列对比，从而得知样品中微生物的种类和比例的高通量测序方法，可广泛分析临床样本微生物组(细菌、真菌、病毒)。相比传统培养方法，mNGS拥有更高敏感性以及更快的检测速度，但是在实际应用中，还有一些难以解决的问题，这也限制其广泛应用：1.无法准确区分检出微生物是定植菌、背景菌、致病菌；2.mNGS技术对于胞内菌、真菌两类微生物检测敏感性较低：由于测序成本的限制，mNGS需尽量排除人源细胞的干扰。因此针对胞内感染菌如结核分枝杆菌、军团菌等，由于其在体液内密度较低而导至检测敏感性偏低；同时mNGS对于具有较厚细胞壁的病原体及真菌核酸提取效率较低，导至检出率和敏感性较低。3.对RNA病毒检测难度大：RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测还存在一定的困难。4.标准难以统一：从测序结果的可靠程度来讲，不同的测序公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度、覆盖度、丰度、估测浓度、置信度，各有千秋，尚无统一标准。5.高宿主背景：一般样本类型如血液、肺泡灌洗液、痰液、胸腹水等，宿主基因组污染比例一般在80％以上，这就导致测到的微生物序列非常少，很大一部分数据都无法有效利用。6.高成本：目前mNGS单项检测(DNA或RNA)，终端收费相对较昂贵，如非危难、重症患者，一般难以接收检测。
技术实现思路
为了解决上述技术问题中的至少一个，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术第一方面提供一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQIDNo.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和SEQIDNo.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56，具体地，所述病原微生物检测引物组包括：由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2组成的第1引物对，靶标病原为副百日咳博德特氏菌；由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4组成的第2引物对，靶标病原为百日咳博德特氏菌；由SEQIDNo.5和SEQIDNo.6组成的第3引物对，靶标病原为回归热螺旋体；由SEQIDNo.7和SEQIDNo.8组成的第4引物对，靶标病原为类鼻疽伯克霍尔德菌；由SEQIDNo.9和SEQIDNo.10组成的第5引物对，靶标病原为肺炎衣原体；由SEQIDNo.11和SEQIDNo.12组成的第6引物对，靶标病原为鹦鹉热衣原体；由SEQIDNo.13和SEQIDNo.14组成的第7引物对，靶标病原为沙眼衣原体；由SEQIDNo.15和SEQIDNo.16组成的第8引物对，靶标病原为艰难梭菌；由SEQIDNo.17和SEQIDNo.18组成的第9引物对，靶标病原为白喉棒状杆菌；由SEQIDNo.19和SEQIDNo.20组成的第10引物对，靶标病原为具核梭杆菌；由SEQIDNo.21和SEQIDNo.22组成的第11引物对，靶标病原为流感嗜血杆菌；由SEQIDNo.23和SEQIDNo.24组成的第12引物对，靶标病原为幽门螺杆菌；由SEQIDNo.25和SEQIDNo.26组成的第13引物对，靶标病原为肺炎克雷伯菌；由SEQIDNo.27和SEQIDNo.28组成的第14引物对，靶标病原为嗜肺军团菌；由SEQIDNo.29和SEQIDNo.30组成的第15引物对，靶标病原为单核球增多性李斯特菌；由SEQIDNo.31和SEQIDNo.32组成的第16引物对，靶标病原为脓肿分枝杆菌；由SEQIDNo.33和SEQIDNo.34组成的第17引物对，靶标病原为鸟型分支杆菌；由SEQIDNo.35和SEQIDNo.36组成的第18引物对，靶标病原为牛型结核菌；由SEQIDNo.37和SEQIDNo.38组成的第19引物对，靶标病原为结核分枝杆菌；由SEQIDNo.39和SEQIDNo.40组成的第20引物对，靶标病原为肺炎支原体；由SEQIDNo.41和SEQIDNo.42组成的第21引物对，靶标病原为淋病奈瑟氏菌；由SEQIDNo.43和SEQIDNo.44组成的第22引物对，靶标病原为恙虫病东方体；由SEQIDNo.45和SEQIDNo.46组成的第23引物对，靶标病原为铜绿假单胞菌；由SEQIDNo.47和SEQIDNo.48组成的第24引物对，靶标病原为酿脓葡萄球菌；由SEQIDNo.49和SEQIDNo.50组成的第25引物对，靶标病原为嗜麦芽窄食单胞菌；由SEQIDNo.51和SEQIDNo.52组成的第26引物对，靶标病原为酿脓链球菌；由SEQIDNo.53和SEQIDNo.54组成的第27引物对，靶标病原为肺炎链球菌；由SEQIDNo.55和SEQIDNo.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，其特征在于，包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，其特征在于，包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQIDNo.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和SEQIDNo.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56。


2.根据权利要求1所述的病原微生物检测引物组，其特征在于，每条正向扩增引物的5'端连接有SEQIDNo.113所示的正向通用引物，每条反向扩增引物的5'端连接有SEQIDNo.114所示的反向通用引物。


3.根据权利要求2所述的病原微生物检测引物组，其特征在于，还包括接头引物对，包括SEQIDNo.116所示的正向接头引物和SEQIDNo.117-123任一所示的反向接头引物。


4.一种基于靶向测序的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的病原微生物检测引物组。


5.根据权利要求4所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶。


6.根据权利要求5所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本总DNA提取试剂、PCR扩增产物纯化试剂。


7.根据权利要求4-6任一所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对照DNA，所述对照DNA的核苷酸序列如SEQIDNo.115所示。


8.一种基于靶向测序的病原微生物检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨仁涛，龚浩，陈澎明，王东生，詹太平，蒋华，
申请(专利权)人：美格医学检验所广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44