一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，特别涉及一种基于信号放大技术的CoVID‑19病毒检测试剂盒。本发明专利技术通过捕获探针与新冠病毒的RNA特定区域杂交后被微孔板上固定的通用引物捕获住，标记探针与新冠病毒的RNA特定区域杂交后留下初级放大探针接头，初级放大探针接头与预放大探针杂交并留下次级放大接头，次级放大接头与放大探针杂交留下报告探针接头，报告探针接头与报告探针杂交留下被标记上的碱性磷酸酶，碱性磷酸酶催化底物发光形成光信号被超敏PMT检测系统检测到。本方案采用了级联探针杂交逐级杂交的办法将检测信号放大至仪器可测定的范围内，基于上述，本发明专利技术提供了一种1600X的信号放大方案极大的增强了信号放大倍数，提升检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒。
技术介绍
新冠肺炎是一种高致病性的下呼吸道病毒感染疾病，引起疾病的病原体为Sars-cov2冠状病毒，冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。但许多症状是可以处理的，因此需根据患者临床情况进行治疗。此外，对感染者的辅助护理可能非常有效。统一分为“疑似病例”和“确诊病例”两类。疑似病例判定分两种情形。一是“有流行病学史中的任何一条，且符合临床表现中任意2条(发热和/或呼吸道症状；具有上述肺炎影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数减少)。二是“无明确流行病学史的，且符合临床表现中的3条(发热和/或呼吸道症状；具有上述肺炎影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数减少)。确诊病例需有病原学证据阳性结果(实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源)。早期有些应急审批的核酸检测试剂厂家采用了生理盐水保存运输拭子样本，这种非灭活的病毒保存方式往往给实验室操作者带来了巨大的操作风险，为了降低直接接触病毒风险，操作者都是将样本置入56度水浴锅中灭活30分钟，这种常规操作可以有效灭活病毒，但是也给病毒本来脆弱的病毒单链RNA造成了极大的破坏，造成了可检测的靶标物急剧减少。现有技术中，实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸假阴性问题来源主要包括：第一、不合理的取样方式；第二、没有明确的样本保存液方案；第三、抽提带来的样本耗损过大；第四、RT-PCR技术本身的缺陷，检测扩增区域有限，通常只有200bp左右，比如不能克服病毒变异导致的假阴性结果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒。相对于传统的RT-PCR检测技术，本专利技术采用了分支链DNA信号放大技术检测新新冠状病毒，方法学上属于独创，能够避免核酸扩增过程中产生的气溶胶带来的污染，以及节省大量的样本制备时间，不受场地限制，可以在普通P2以下级别实验室操作。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了探针组合，包括捕获探针，所述捕获探针具有：(I)、如SEQIDNo.1～395任一项所示的核苷酸序列；(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；(III)、与(I)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的探针组合还包括预放大探针、放大探针和/或探针标记物。基于上述研究，本专利技术还提供了所述的探针组合在制备病毒检测试剂或试剂盒中的应用。基于上述研究，本专利技术还提供了所述的探针组合在级联信号放大中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述捕获探针杂交的温度为55℃±3℃，时间为150min±15min。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述预放大探针杂交的温度为55℃±3℃，时间为50±15min。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述放大探针杂交的温度为55℃±3℃，时间为50±15min。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述探针标记物的报告探针标记温度为50℃±3℃，时间为50±15min。在本专利技术的一些具体实施方案中，底物发光的温度为30℃±7℃，时间为30±5min。本专利技术还提供了样本保存液，以重量含量计，包括如下组分：基于上述，本专利技术还提供了所述的样本保存液在制备病毒检测试剂或试剂盒中的应用。泵重要的是，本专利技术还提供了病毒检测的试剂或试剂盒，其特征在于，包括所述的探针组合和/或所述的样本保存液以及可接受的助剂。此外，本专利技术还提供了病毒检测的方法，以所述的样本保存液提取保存病毒核酸，经所述的探针组合级联放大检测。本专利技术针对性开发了样本保存液，病毒保存液采用高浓度的胍盐将拭子采集的病毒蛋白质一次破裂灭活变性，同时高浓度的胍盐有效的抑制了样本中Rnase酶活性，使得的病毒RNA能够极大程度保持完整。针对病毒抽RNA提过程，目前两家商业化试剂盒厂家的产品对比，通过我们的对国产T厂家(DP315)、进口K厂家的病毒核酸提取试剂盒(52906)的提取效率对比表明，国产T厂家的提取效率只有进口K厂家试剂盒的一半，二者使用的硅胶吸附柱有很大的区别，我们团队采用的E厂家提取柱，提取效率与进口K厂家接近，可最大程度保证核酸的回收率，降低使用成本。本专利技术的探针检测覆盖区域达到了12.2K，基本上覆盖了病毒29.6K基因组的大部分区域，特异性的针对ORF1ab(8.3K)、S(2.6K)、N(1.3K)区域设计了针对性的引物序列，不会因为像PCR技术因为单位点或多位点SNP突变导致检测漏诊，覆盖区域详见图1。本专利技术还提供了一种增强型的1600X信号放大方案，传统分支链信号放大技术，由于技术限制，只能制备出来256X(Siemens)左右的放大系统，本专利技术突变现有技术瓶颈，提供了一种1600X的信号放大方案极大的增强了信号放大倍数，提升检测灵敏度。检测原理如图2所示。综上，相对于传统的RT-PCR检测技术，本专利技术采用了分支链DNA信号放大技术检测新新冠状病毒，方法学上属于独创，能够避免核酸扩增过程中产生的气溶胶带来的污染，以及节省大量的样本制备时间，不受场地限制，可以在普通P2以下级别实验室操作。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示本专利技术提供的探针检测覆盖区域；图2示增强型的1600X信号放大方案的基本原理；图3示样本处理流程；图4示检测流程图；图5示全自动检测仪。具体实施方式本专利技术公开了一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。针对性开发了样本保存液，病毒保存液采用高浓度的胍盐将拭子采集的病毒蛋白质一次破裂灭活变性，同时高浓度的胍盐有效的抑制了样本中Rnase酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.探针组合，其特征在于，包括捕获探针，所述捕获探针具有：/n(I)、如SEQ ID No.1～395任一项所示的核苷酸序列；/n(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；/n(III)、与(I)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.探针组合，其特征在于，包括捕获探针，所述捕获探针具有：
(I)、如SEQIDNo.1～395任一项所示的核苷酸序列；
(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(III)、与(I)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。


2.如权利要求1所述的探针组合，其特征在于，还包括预放大探针、放大探针和/或探针标记物。


3.如权利要求1或2所述的探针组合在制备病毒检测试剂或试剂盒中的应用。


4.如权利要求1或2所述的探针组合在级联信号放大中的应用。


5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述捕获探针杂交的温度为55℃±3℃，时间为150min±15min。


6.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨焕，刘一丁，李先坤，孟歌，马政威，张鹭鹭，何丽，韩燃，
申请(专利权)人：郑州科蒂亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41