一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种微生物检测方法，特别涉及一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT‑PCR)技术考察对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中与细胞壁形成、粘附、生物被膜形成相关基因的表达变化来选择一种在VBNC状态中也高效表达的基因用于检测VBNC状态金黄色葡萄球菌，发现VBNC状态金黄色葡萄球菌sarA的表达和对数生长期金黄色葡萄球菌液的相比没有显著性差异，因此以全局调控因子sarA作为依赖于mRNA的反转录PCR技术的靶标来检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌。

【技术实现步骤摘要】
一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法
本专利技术涉及一种微生物检测方法，特别涉及一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法。
技术介绍
食源性病原体可通过食物导致人类患严重疾病，金黄色葡萄球菌是重要的病原菌之一，容易污染牛奶、肉、蛋和鱼等高蛋白食品。食品中的金黄色葡萄球菌在一定条件下会产生肠毒素，导致食物中毒，由金黄色葡萄球菌引起的食品安全问题广泛存在，引起人们的广泛关注。细菌的活的不可培养状态(Viablebutnonculturable，VBNC)状态又称为活的非可培养。处于这种状态的细菌虽然不能在其常用培养基上形成菌落，但仍具有代谢活性，而且在适当条件下复苏后可以恢复到可培养状态。食源性致病菌在食品加工、贮藏过程中，受到多种因素影响，这些因素可能会诱导其进入VBNC状态。有些VBNC状态致病菌仍保留致病活性，有些VBNC状态致病菌虽然丧失致病性但复苏后致病性会随之恢复，因此VBNC状态致病菌给食品安全和质量带来隐患。如何检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌是降低这种致病菌感染的关键之一。平板计数法常被用于微生物检测，但却无法检测到VBNC状态细菌。虽然对于VBNC状态细菌的检测仍没有标准化的方法，但分子生物学方法在检测VBNC状态细菌方面具有一定优势，比如叠氮溴化乙锭(EMA)或叠氮溴化丙锭(PMA)与聚合酶链式反应(PCR)或LAMP技术结合的检测方法，以及基于mRNA的反转录PCR法。这些方法可避免死菌带来的假阳性，因此可有效检测活的VBNC状态细菌。但现有方法操作复杂，检测灵敏度相对较低，提高对VBNC状态细菌检测的灵敏度是十分必要的，也是目前需要克服的技术障碍，因此，需要提供一种灵敏度高、操作方便的检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，推动VBNC状态细菌检测的应用。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述技术问题，提供一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术考察对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中与细胞壁形成、粘附、生物被膜形成相关基因的表达变化来选择一种在VBNC状态中也高效表达的基因用于检测VBNC状态金黄色葡萄球菌，发现VBNC状态金黄色葡萄球菌sarA的表达和对数生长期金黄色葡萄球菌液的相比没有显著性差异，因此以全局调控因子sarA作为依赖于mRNA的反转录PCR技术的靶标来检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌。检测方法具体包括以下步骤：(1)取30mL的待测菌液样品，在4℃条件下以8000×g重复离心多次富集菌体，加入1mL的0.85％NaCl溶液重悬；(2)分别取1.5mL和1mL的对数生长期金黄色葡萄球菌液和重悬的待测菌液样品于4℃条件下，以13400×g离心2min收集菌体；(3)用RNase-FreeddH2O洗涤2次，去除上清液；(4)加入100μL1mg/mL的溶葡萄球菌酶于37℃恒温水浴锅中处理1h；(5)使用RNA提取试剂盒进行RNA的提取；(6)使用超微量紫外可见分光光度计对RNA的提取样品进行检测，测定260nm和280nm吸收值；(7)对提取好的RNA溶液进行反转录；(8)对反转录的样品进行处理，配制PCR反应液，引物序列见下表1-3；表1金黄色葡萄球菌生物被膜形成相关基因和内参gyrB引物序列表2金黄色葡萄球菌pbp1基因和ebpS基因序列表3金黄色葡萄球菌生物被膜形成相关基因序列(9)通过StepOnePlusReal-timePCR系统采用两步法PCR的扩增标准程序进行扩增：第一步：预变性，95℃，30s，重复1次；第二步：PCR反应，95℃，5s，60℃，30s，重复40次；(10)以gyrB作为内参，用2-△△CT法计算基因表达水平的倍数变化，待测菌液样品中pbp1、ebps、icaA、icaB、icaC、icaD、fnbA、fnbB、ebh和agrA的表达水平显著低于对数生长期，sarA的表达和对数生长期金黄色葡萄球菌液的相比没有显著性差异，从数据分析上看，P值＞0.05，证明待测菌液样品中存在不可培养状态金黄色葡萄球菌。步骤(1)中，待测菌液样品中可培养菌数为0，活菌总数不为0。步骤(5)中，RNA的提取使用RNAprepPure总RNA提取试剂盒并按照说明书进行，离心皆在25℃条件下操作。步骤(7)中，反转录过程按照MaximaHMinusFirstStrandcDNASynthesisKitwithdsDNase试剂盒说明书进行，实验全程在冰盒上进行操作步骤(8)中，使用TBPremixExTaqTMII试剂盒，对反转录的样品进行处理，按下列的组份配制PCR反应液：TBGreenPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(2X)10μL，PCRForwardPrimer(10μM)0.4μL，PCRReversePrimer(10μM)0.4μL，ROXReferenceDye(50X)0.4μL，DNA模板2μL，灭菌水6.8μL，总体积20μL，步骤(9)中，通过StepOnePlusReal-timePCR系统采用两步法PCR的扩增标准程序在20μL的总反应体积下进行扩增。本专利技术的有益效果：本专利技术发现了一种在VBNC状态金黄色葡萄球菌中高效表达的基因，VBNC状态金黄色葡萄球菌sarA的表达和对数生长期金黄色葡萄球菌液的相比没有显著性差异，该基因可以作为反转录PCR技术的分子标靶用于对VBNC状态金黄色葡萄球菌的检测，大幅提高检测灵敏度，有助于有效地评价VBNC细菌的潜在危害。附图说明图1是流式细胞仪检测下-20℃柠檬酸诱导金黄色葡萄球菌活细胞的百分率。图2是pbp1在对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中的相对表达(**表示P＜0.01)。图3是ebps在对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中的相对表达(***表示P＜0.001)。图4是9种生物被膜形成相关基因在对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中的相对表达(***表示P＜0.001)。具体实施方式本专利技术首先在-20℃条件下，以柠檬酸-磷酸氢二钠溶液(pH4.0)作为诱导液诱导金黄色葡萄球菌进入VBNC状态。通过qRT-PCR检测对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中pbp1基因表达的变化。通过qRT-PCR检测对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中ebpS基因表达的变化。通过qRT-PCR检测对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中9个与生物被膜形成相关基因的表达变化，包括icaA、icaB、icaC、icaD、fnbA、fnbB、ebh、agrA和sarA。实验1.金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导和检测方法：(1)从-80℃低温冰箱中取出冻藏的金黄色葡萄球菌NCTC8325-4菌种，在提前倒好本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：以全局调控因子sarA作为依赖于mRNA的反转录PCR技术的靶基因来检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：以全局调控因子sarA作为依赖于mRNA的反转录PCR技术的靶基因来检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌。


2.根据权利要求1所述的一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取30mL的待测菌液样品，在4℃条件下以8000×g重复离心多次富集菌体，加入1mL的0.85％NaCl溶液重悬；
(2)分别取1.5mL和1mL的对数生长期金黄色葡萄球菌液和重悬的待测菌液样品于4℃条件下，以13400×g离心2min收集菌体；
(3)用RNase-FreeddH2O洗涤2次，去除上清液；
(4)加入100μL1mg/mL的溶葡萄球菌酶于37℃恒温水浴锅中处理1h；
(5)使用RNA提取试剂盒进行RNA的提取；
(6)使用超微量紫外可见分光光度计对RNA的提取样品进行检测，测定260nm和280nm吸收值；
(7)对提取好的RNA溶液进行反转录；
(8)对反转录的样品进行处理，配制PCR反应液，引物序列见下表1；
表1金黄色葡萄球菌sarA基因和内参gyrB引物序列



(9)通过StepOnePlusReal-timePCR系统采用两步法PCR的扩增标准程序进行扩增：第一步：预变性，95℃，30s，重复1次；第二步：PCR反应，95℃，5s，60℃，30s，重复40次；
(10)以gyrB作为内参，用法计算基因表达水平的倍数变化，待测菌液样品中sarA的表达和对数生长期金黄色葡萄球菌液的相比没有显著性差异，从数据分析上看，P值＞0.05，证明待测菌液样品中存在不可培养状态金黄色葡萄球菌。


3.根据权利要求2所述的一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤(1)中，待测菌液样品中...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫海洋，李萌，赵凤，孟玲玲，杨朔，卢元元，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22