黄牛DYNC1I2基因CNV标记快速辅助检测生长性状的方法及专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种黄牛DYNC1I2基因CNV标记快速辅助检测生长性状的方法及专用试剂盒，以牛血液全基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR技术，用两对引物P1、P2分别对牛DYNC1I2基因CNV区域、内参基因BTF3的一段区域进行扩增，根据2*2

【技术实现步骤摘要】
黄牛DYNC1I2基因CNV标记快速辅助检测生长性状的方法及专用试剂盒
本专利技术涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于qPCR技术检测牛DYNC1I2基因CNV标记的方法。
技术介绍
随着肉牛育种的方向由常规的表型选育向分子育种发展，目前，牛分子育种研究主要集中在以分子标记为基础的标记辅助选择方面。分子育种，即分子标记辅助选择(molecularmark-assistselection,MAS)，借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的。拷贝数变异(CopyNumberVariations,CNVs)，是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间，包括拷贝数增加(Copynumbergain)和拷贝数减少(Copynumberloss)。与单核苷酸多态性(SNP)相比，CNVs覆盖了基因组更多的核苷酸区域，其作为遗传变异的来源，可以通过基因拷贝数或其相关调控元件的变异引起的基因剂量效应，决定个体多样性的表型。基因组未知拷贝数变异可以采用基于微阵列的比较基因组杂交(CGH)的方法以及新一代直接测序技术进行检测。对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。例如qPCR、QMPSF、MLPA、FISH、Southernblotting和MAPH。其中，实时荧光定量PCR(qPCR)最为常用。根据qPCR所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。染料法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数，通过对目的基因(具有拷贝数变异)及内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，并根据2-ΔΔCt方法统计可以检测样本候选基因区域的拷贝数。DYNC1I2是细胞质动力蛋白的中间链，细胞质动力蛋白(cytoplasmicdyneins)在细胞中至少有两个功能：1)有丝分裂中染色体运动的力的来源；2)作为负端微管走向的发动机，担负小泡和各种膜结合细胞器的运输任务。在神经细胞中，细胞质动力蛋白参与将细胞质细胞器向神经节的细胞体运输。在成纤维细胞中，细胞质动力蛋白负责将细胞器，包括高尔基体小泡、溶酶体和内体等向细胞中心运输。体外实验表明，细胞质动力蛋白在微管上移动的方向与驱动蛋白相反，从正端移向负端。目前，尚未见有关DYNC1I2基因CNV对地方牛品种生长性状影响的文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄牛DYNC1I2基因CNV标记快速辅助检测生长性状的方法及专用试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种检测牛DYNC1I2基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以待测牛个体基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增DYNC1I2基因的拷贝数变异区域的部分片段以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定牛个体DYNC1I2基因的拷贝数变异类型；所述的引物对P1为：上游引物F1：5’-AAGTACAAGTGCCTCAAACTTCT-3’下游引物R1：5’-CCAAACCGTGAAAATAAGACCA-3’所述的引物对P2为：上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为135bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。优选的，所述的DYNC1I2基因的拷贝数变异区域位于牛DYNC1I2基因参考基因组序列AC_000159.1的24941201bp-24944000bp。优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型(Gain)，2*2-ΔΔCt>2；缺失型(Loss)，2*2-ΔΔCt<2；正常型(Median)，2*2-ΔΔC＝2。优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系包括10ng/μL模板DNA1μL以及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火20s，39个循环。上述检测牛DYNC1I2基因拷贝数变异的方法在牛分子标记辅助选择育种中的应用。优选的，在皮南牛中，拷贝数变异类型为多拷贝型的个体在体斜长这个生长性状上显著优于缺失型及正常型的个体；在秦川牛中，拷贝数变异类型为缺失型或正常型的个体在胸宽、坐骨端宽和腰角宽这三个生长性状上显著优于多拷贝型的个体；在夏南牛中，拷贝数变异类型为缺失型或正常型的个体在十字部高这个生长性状上显著优于多拷贝型的个体；在云岭牛中，拷贝数变异类型为多拷贝型的个体在胸深这个生长性状上显著优于缺失型的个体。一种检测牛DYNC1I2基因拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1以及引物对P2。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术以牛DYNC1I2基因参考区域Chr2:24941201bp-24944000bp为位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在牛群体中的拷贝数变异情况，并与体斜长、腰角宽等重要经济性状进行关联分析；关联分析结果表明，牛DYNC1I2基因这一CNV位点与牛重要生长性状显著相关，存在牛生长性状的标记辅助选择的DNA分子标记(CNV标记)，可以用于快速建立遗传资源优良的牛种群，从而加快良种选育进程。与现有技术相比，本专利技术有以下优点：(1)本专利技术提供的牛DYNC1I2基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于母牛的早期选育。(2)检测DYNC1I2基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便。(3)DYNC1I2基因拷贝数变异位点的检出，为牛的分子标记辅助选择提供科学依据。附图说明图1为本专利技术实施例中进行qPCR(DYNC1I2基因)绘制的扩增曲线。图2是本专利技术实施例中进行qPCR(DYNC1I2基因)绘制的熔解曲线。图3为本专利技术实施例中检测的DYNC1I2基因拷贝数变异在牛群体中的分布。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本专利技术，而非对本专利技术保护范围的限制。本专利技术针对重测序中筛选出的牛DYNC1I2基因(GenBankAccessionNo.AC_000159.1)拷贝数变异区域Chr2:24941201bp-24944000bp，利用qPCR对牛DYNC1I2基因的拷贝数变异进行检测，并揭示了存在于牛DYNC1I2基因的CNV标记。具体说明如下。1.样品的采集及基因组DNA提取(1)血样采集和数据收集表1.试验动物样品信息本专利技术中共采集血样602个，样本均为2岁以上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测牛DYNC1I2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n以牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增DYNC1I2基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定牛DYNC1I2基因的拷贝数变异类型；/n所述的引物对P1为：/n上游引物F1：5’-AAGTACAAGTGCCTCAAACTTCT-3’/n下游引物R1：5’-CCAAACCGTGAAAATAAGACCA-3’/n所述的引物对P2为：/n上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’/n下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测牛DYNC1I2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增DYNC1I2基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定牛DYNC1I2基因的拷贝数变异类型；
所述的引物对P1为：
上游引物F1：5’-AAGTACAAGTGCCTCAAACTTCT-3’
下游引物R1：5’-CCAAACCGTGAAAATAAGACCA-3’
所述的引物对P2为：
上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’
下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。


2.根据权利要求1所述一种检测牛DYNC1I2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述DYNC1I2基因的拷贝数变异区域位于牛DYN1L2基因参考基因组序列AC_000159.1的24941201bp-24944000bp。


3.根据权利要求1所述一种检测牛DYNC1I2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述牛DYNC1I2基因的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2-ΔΔCt>2；缺失型，2*2-ΔΔCt<2；正常型，2*2-ΔΔCt＝2。


4.根据权利要求1所述一种检测牛DYNC1I2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述引物对P1的扩增产物片段大小为135bp，引物对P2的扩增产物片段大小为166bp。

【专利技术属性】
技术研发人员：黄永震，丁晓婷，贺花，李欣淼，刘贤，柴亚楠，李克丽，牛梦晓，乔小玉，郑中华，张子敬，施巧婷，王二耀，茹宝瑞，胡沈荣，王建钦，雷初朝，陈宏，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61