单细胞全基因组扩增试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基因组扩增方法，试剂盒及其应用。本发明专利技术公开了一种单细胞全基因组扩增的方法，包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他扩增反应必需的试剂进行扩增反应。本发明专利技术还公开了一种扩增试剂盒以及上述扩增方法和扩增试剂盒的应用。本发明专利技术公开的扩增方法和试剂盒可以降低扩增过程中造成的偏差，具有高效稳定扩增效果，能够提高单细胞扩增的基因组覆盖度。

【技术实现步骤摘要】
单细胞全基因组扩增试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种基因组扩增方法，试剂盒及其应用。
技术介绍
DNA测序技术的快速发展使得学术界对包括人类在内的各类物种的基因组有了更全面的认识，下一代测序的全基因组扩增(whole-genomeamplification，WGA)在生物学和医学领域都有广泛的应用。随着测序技术、单细胞分离技术和全基因组扩增技术的快速发展，单细胞研究技术被列为未来几年最值得关注的技术之一。在单细胞水平上对基因组进行测序能更好地解决传统技术的局限性问题。单细胞全基因组扩增技术的难点在于单细胞的分离和全基因组的扩增。单细胞全基因组扩增技术是进行单细胞测序的前提，该技术可用于揭示单细胞基因组结构差异。单细胞基因组测序常见的方法需要使用DNA聚合酶和高通量的短尾DNA测序，对单个细胞的基因组进行广泛的体外扩增。这些方法有两个显著的缺点，一是聚合酶复制错误可能会产生成千上万的假阳性，二是相对较短的序列读取几乎不包含任何单倍类型的信息。此外，单细胞研究技术存在一些问题，如扩增偏倚性、非特异性扩增、灵敏度不高、重复性差、操作失误率高、存在外来污染等。例如，MDA是目前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进行高保真的均匀扩增，扩增出10～100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列。但是MDA也有一些缺点，特别是显著的非特异扩增，另外就是仍然存在扩增偏好性[9]。单细胞分离技术也会对基因组扩增造成影响。研究表明，细菌细胞在单细胞拉曼微谱学分析过程中，直接激光照射后，其膜完整性会丧失，甚至导致大量细胞死亡，拉曼分析分选时的激光辐射对细胞的生理活性会造成一定损伤[10]。此外，由于激光辐射引起胞内核酸损伤等可能原因，弹射后常规细菌单细胞测序的覆盖度一般不超过20％,因此基因组拼装相对困难[11,12]。针对这些问题，如何提高扩增准确性、覆盖率和操作便捷是未来科研工作者的研究方向。1.AssmannC,KirchhoffJ,BeleitesC,HeyJ,KostudisS,PfisterW,etal.IdentificationofvancomycininteractionwithEnterococcusfaecaliswithin30minofinteractiontimeusingRamanspectroscopy.AnalBioanalChem2015；407(27):8343-8352.2.SchroderUC,BeleitesC,AssmannC,GlaserU,HubnerU,PfisterW,etal.Detectionofvancomycinresistancesinenterococciwithin31/2hours.SciRep-Uk2015；5.3.TengL,WangX,WangX,GouH,RenL,WangT,etal.Label-free,rapidandquantitativephenotypingofstressresponseinE.coliviaramanome.SciRep2016；6:34359.4.Gruber-VodickaHR,DirksU,LeischN,BaranyiC,StoeckerK,BulgheresiS,etal.Paracatenula,anancientsymbiosisbetweenthiotrophicAlphaproteobacteriaandcatenulidflatworms.PNatlAcadSciUSA2011；108(29):12078-12083.5.BriersY,StaubliT,SchmidMC,WagnerM,SchupplerM,LoessnerMJ.IntracellularVesiclesasReproductionElementsinCellWall-DeficientL-FormBacteria.PlosOne2012；7(6).6.MajedN,ChernenkoT,DiemM,GuAZ.IdentificationofFunctionallyRelevantPopulationsinEnhancedBiologicalPhosphorusRemovalProcessesBasedOnIntracellularPolymersProfilesandInsightsintotheMetabolicDiversityandHeterogeneity.EnvironSciTechnol2012；46(9):5010-5017.7.MiluckaJ,FerdelmanTG,PolereckyL,FranzkeD,WegenerG,SchmidM,etal.Zero-valentsulphurisakeyintermediateinmarinemethaneoxidation.Nature2012；491(7425):541-+.8.LiMQ,CanniffeDP,JacksonPJ,DavisonPA,FitzGeraldS,DickmanMJ,etal.RapidresonanceRamanmicrospectroscopytoprobecarbondioxidefixationbysinglecellsinmicrobialcommunities.IsmeJournal2012；6(4):875-8859Woyke,T.,D.F.R.Doud,andF.Schulz,Thetrajectoryofmicrobialsingle-cellsequencing.NatMethods,2017.14(11):p.1045-1054.10Mathey,R.,etal.,Viabilityof3hgrownbacterialmicro-coloniesafterdirectRamanidentification.JMicrobiolMethods,2015.109:p.67-73.11JingX,GouH,GongY,etal.Raman-activatedcellsortingandmetagenomicsequencingrevealingcarbon-fixingbacteriaintheocean.EnvironmentMicrobiology,2018,4:29727057.12SongY,KasterAK,VollmersJ,etal.Single-cellgenomicsbasedonRamansortingrevealsnovelcarotenoid-containingbacteriaintheRedSea.MicrobalBiotechnology,2017,10(1):125-137.13YuanX,SongY,SongY,etal.EffectoflaserirradiationoncellfunctionanditsimplicationsinRamanSpectroscopy.AppliedandE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：/na.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；/nb.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；/nc.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他扩增反应必需的试剂进行扩增反应。/n

【技术特征摘要】
1.一种单细胞基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；
b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；
c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他扩增反应必需的试剂进行扩增反应。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油相选自矿物油、氟碳油、硅烷油中的任一种或其任意组合。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述油相还包含表面活性剂，优选的，表面活性剂是span-80或EM90。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，单细胞样本与油相混合比例为1:0.5至1:20。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单细胞样本是通过激光辐射分选获得的样本。


6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的激光辐射分选为拉曼信号分选。
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐健，苏晓璐，籍月彤，荆晓艳，公衍海，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37