人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。本发明专利技术揭示了基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体。本发明专利技术的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且外源基因装载量高。本发明专利技术的腺病毒载体可应用于作为各种各样的基因的表达载体，应用于疫苗研发、基因治疗等。本发明专利技术还提供了由所述腺病毒载体包装获得的病毒等。

【技术实现步骤摘要】
人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用
本专利技术属于生物医学以及病毒学领域，更具体地，本专利技术涉及一种人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。
技术介绍
腺病毒载体是目前最有应用前景的病毒载体之一。腺病毒是一种无包膜、线性的双链DNA病毒，基因组大小约为36kb。自1953年首次发现腺病毒至今，已分离出57种人血清型(分为A～G7个亚属)及多种其它种属来源的腺病毒，其中包括C亚型人腺病毒，例如AdHu1，AdHu2，AdHu5，AdHu6等。腺病毒由于转导效率高、可携带外源基因，易于扩增及纯化，被视为优良的基因运载工具，广泛应用于各种基础研究或临床应用，包括研发针对HIV、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、前列腺癌、黑色素瘤等疾病的疫苗，以及用于溶瘤治疗。然而，由于75-80％的个体中存在抗AdHu5的预存中和抗体，以AdHu5为载体的疫苗，其免疫效果受预存中和抗体的影响，不仅削弱其免疫效果，而且可能增强副反应。为避免这一问题，本专利技术人之前选择稀有血清型或其它种属来源的腺病毒作为疫苗载体，如黑猩猩型腺病毒等。黑猩猩型腺病毒只流行于非洲的黑猩猩中，人群中一般不含抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，故以黑猩猩型腺病毒为疫苗载体，其综合免疫效果优于AdHu5载体。由于腺病毒基因组相对较大，一般的分子生物学方法难以完成重组腺病毒载体的构建，因此，腺病毒载体的构建依然是一个技术瓶颈。传统的腺病毒载体构建策略主要为同源重组和基因组直接克隆，这些策略费时费力，最快也需要2个多月时间。进一步改良的策略为等温组装法，虽然这种方法声称只需要1周左右，但这只是指将多个片断用等温组装法连接在一起成为一个克隆所需的时间，尚不包括获得接头部位存在互补序列的多个小片段所需的时间以及验证过程。而且，以上这些策略都必须首先获得野生型病毒，并扩增纯化病毒，获得其基因组DNA。如果只知腺病毒基因序列，则无法完成腺病毒载体的构建。根据上述，本领域还需要进行进一步的研究探索，来获得改进的腺病毒载体以及腺病毒，增强其临床上的应用性。在本专利技术人在先研究工作(未公开的专利申请CN201910777937.2)中，基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，删除其E1序列和E3序列，改造其E4序列；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。而本专利技术提出了进一步优化的腺病毒载体以及腺病毒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，完全删除其E1序列，改造其E3序列和E4序列，所述改造包括(但不限于)：(1)改造其E3序列，保留其orf9、较佳地保留其orf9和orf1，部分或全部删除其它E3的orf序列(例如，删除其orf1～orf8序列或orf2～orf8序列)；和，(2)改造其E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf3。在本专利技术的另一方面，提供一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列被完全删除，E3序列和E4序列被改造；所述改造包括：(1)E3序列中，其orf9被保留、较佳地其orf9和orf1被保留，其它orf序列部分或全部被删除(例如，其orf1～orf8序列被删除或orf2～orf8序列被删除)；和，(2)E4序列中，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地其E4序列中orf1、orf2和/或orf3被删除。在一个优选例中，(2)中，所述C亚型人腺病毒包括(但不限于)：人血清5型腺病毒AdHu5，AdHu1，AdHu2，AdHu6；较佳地为AdHu5。在另一优选例中(2)中，E4序列改造包括选自：(a)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3(保留AdC68来源的orf4)；(b)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；(c)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；(d)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7。在另一优选例中，所述改造包括选自：(i)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6，删除其E4序列中orf1、orf2和orf3(保留AdC68来源的orf4)(AdC68XY9-EGFP)；(ii)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7(AdC68XY8-EGFP)；(iii)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列(AdC68XY7-EGFP)；(iv)删除其E3序列中orf1～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7(AdC68XY6-EGFP)；(v)删除其E3序列中orf1～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列(AdC68XY5-EGFP)；(vi)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7(AdC68XY10-EGFP)。在另一更具体的优选例中，所述删除其E1序列为删除其基因组(黑猩猩型腺病毒AdC68基因组)序列(序列位点的计算基于GenBank登录号：AC_000011，后同)中第459-3402位序列；或(i)中，删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，完全删除其E1序列，改造其E3序列和E4序列，所述改造包括：/n(1)改造其E3序列，保留其orf9、较佳地保留其orf9和orf1，部分或全部删除其它E3的orf序列；和/n(2)改造其E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf3。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，完全删除其E1序列，改造其E3序列和E4序列，所述改造包括：
(1)改造其E3序列，保留其orf9、较佳地保留其orf9和orf1，部分或全部删除其它E3的orf序列；和
(2)改造其E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf3。


2.一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列被完全删除，E3序列和E4序列被改造；所述改造包括：
(1)E3序列中，其orf9被保留、较佳地其orf9和orf1被保留，其它orf序列部分或全部被删除；和
(2)E4序列中，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地其E4序列中orf1、orf2和/或orf3被删除。


3.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，(2)中，所述C亚型人腺病毒包括(但不限于)：人血清5型腺病毒AdHu5，AdHu1，AdHu2，AdHu6；较佳地为AdHu5。


4.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，(2)中，E4序列改造包括选自：
(a)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3；
(b)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；
(c)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；
(d)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7。


5.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述改造包括选自：
(i)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6，删除其E4序列中orf1、orf2和orf3；
(ii)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；
(iii)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；
(iv)删除其E3序列中orf1～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；
(v)删除其E3序列中orf1～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf...

【专利技术属性】
技术研发人员：周东明，邢嫚，
申请(专利权)人：苏州相奕生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32