一种环二核苷酸或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种环二核苷酸(cyclic dinucleotides,cDN)或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂及其应用。所述的制剂由中性胞苷脂材DNCA、阳离子脂材CLD、PEG2000‑DSPE、金属盐/PBS缓冲体系以及环二核苷酸组成。经过本发明专利技术方法包载后得到的环二核苷酸或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂，具有稳定性好、递送效率高、入胞能力强、生物活性高且毒性低等优点，在抗肿瘤免疫、抗病毒/细菌感染及自身免疫疾病治疗方面具有重要的潜在应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种环二核苷酸或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂及其应用
本专利技术涉及一种由中性/阳离子混合脂材包载的环二核苷酸(cDN)或其类似物的纳米制剂、还涉及该制剂的制备方法和应用。本专利技术属于生物医药

技术介绍
迄今为止，共发现四例环二核苷酸(cyclicdinucleotides,cDN)类第二信使分子，来源于微生物的环二鸟苷酸(cyclicdimericguanosinemonophosphate,c-di-GMP)、环二腺苷酸(c-di-AMP)及3′,3′-环鸟苷腺苷酸(3′,3′-cGAMP)；及哺乳动物体内发现的2′,3′-环鸟苷腺苷酸(2′,3′-cGAMP)，它们在生命体系的信号转导系统中发挥着重要的调控作用。J.Chen课题组于2013年发现其靶标为天然免疫信号通路中的关键接头蛋白—干扰素基因刺激因子(STING)。STING被激活后从内质网膜转运至高尔基体，同时细胞质中的TANK结合激酶1(TANK-bindingkinase1,TBK1)被募集至高尔基体中发生自磷酸化，并结合STING使其磷酸化。携带STING-TBK1复合物的囊泡随后转移到核周区域，并与结构保守带正电的IRF3结合，IRF3被TBK1磷酸化激活，随后与STING蛋白解离，二聚化，易位到细胞核中以诱导干扰素(interferon,IFN)及其它细胞因子的表达。STING蛋白已被证实与肿瘤、病原微生物感染、自身免疫等多种疾病的发生发展密切相关，cDN类化合物作为其激动剂，已然成为继免疫检查点抑制剂之后的肿瘤免疫治疗的潜力药物，目前正在进行I期临床试验，并获得了令人鼓舞的初步结果。然而cDN类化合物存在易被磷酸二酯酶降解、给药后容易发生随机扩散和清除及带负电荷导致的跨膜困难等问题，使临床应用受到限制。化学结构修饰和载体递送是解决上述问题的两个有效策略，AduroBiotech公司开发的Rp,Rp-2′,3′-c-diAMPSS(ADU-S100)是第一个进入临床试验cDN类似物，其在THP-1细胞中的EC50为41.5μmol·L-1，明显高于2',3'-cGAMP(EC50252.5μmol·L-1)，且ADU-S100注射给药可以显著抑制肿瘤生长及癌细胞转移。此后，AduroBiotech公司与诺华制药公司在ADU-S100的基础上，合作开发了得到了活性最优的核糖3′-位双F取代cDN类似物，其EC50值为4.5μmol·L-1，与ADU-S100相比提高了8倍。化学修饰提高了cDN类分子的稳定性及与靶标STING的亲和力，但依然存在负电荷难以跨膜的问题，且活性浓度远高于体内生理浓度，具有潜在的药物毒性问题。目前正在进行临床研究的cDN类药物均未涉及载体递送技术，新型高效低毒的递送载体可以有效弥补化学修饰所不能解决的问题，保障cDN分子稳定性的同时进一步降低其给药浓度。传统药物载体包括阳离子脂质体和阳离子聚合物两大类，由于表面正电荷的存在，可以通过静电相互作用与药物结合，但静脉注射后会与带负电荷的血清蛋白结合，导致靶向性差并且无法在体内长时间循环；且可以与细胞中的生物膜相结合，破坏其正常膜结构，产生较强的体内毒性。本专利技术人前期设计合成了胞苷乙酰胺甘油醚分子DNCA(CN108059619A)，可以通过氢键和π-π堆积作用结合并包载核酸药物(CN1084478807A)。结合DNCA及专利技术人前期设计合成的以胱氨酸为骨架的阳离子脂材CLD，在降低阳离子脂材毒性的同时，高效转染3′,3″-双肽-siRNA缀合物并已在细胞水平成功应用(MolPharm,2019,16,4920)。对递送系统进一步优化，重新制定并探索了最优的DNCA/CLD处方，辅以PEG2000-DSPE及PBS/Ca2+，获得了高效低毒的中性/阳离子混合脂材递送系统(简称Mix递送系统)；结合专利技术人前期设计的环二鸟苷酸及其类似物的新型一釜亚磷酰胺合成法(CN102199183B)，合成并分离得到了活性最优的单一构型化合物Rp,Rp-3′,3′-di(2′-F)-cGsAsMP(RAW-LuciaISG细胞的EC50为200nM，在THP1-DualISG细胞的EC50为159nM)和次优化合物RpS-cdG(RAW-LuciaISG细胞的EC50为329nM)，创新设计了高效低毒的cDN/Mix制剂。化学修饰与载体相结合的修饰方法显著提高了cDN类药物的体内外稳定性，并可在较低剂量给药实现较好的肿瘤(包括但不限于黑色素瘤和乳腺癌)免疫治疗效果，3′,3′-cGAMP/Mix制剂5μg瘤内给药治疗黑色素瘤小鼠可实现43％小鼠长期生存，且83％长期存活小鼠产生了肿瘤特异性免疫记忆，再次接种肿瘤未见肿瘤生长；乳腺癌小鼠尾静脉给药后有11％实现了长期生存，制剂在全身递送中稳定性较好，肿瘤抑制效果显著优于未包载的cDN。RpS-cdG和Rp,Rp-3′,3′-di(2′-F)-cGsAsMP活性进一步提高，经Mix包载后0.1μg瘤内给药即可实现22％和12.5％的乳腺癌小鼠完全治愈。该纳米制剂具有稳定性好、递送效率高、入胞能力强、毒性低且生物活性好等优点，在抗肿瘤免疫、抗感染及自身免疫疾病治疗方面具有重要的潜在应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效低毒的中性/阳离子混合脂材包载的环二核苷酸或其类似物的纳米制剂及其制备方法，以提高此类药物的成药性。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种环二核苷酸(cyclicdinucleotides,cDN)或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂，命名为cDN/Mix，所述的纳米制剂由中性胞苷脂材DNCA、阳离子脂材CLD、PEG2000-DSPE、金属盐/PBS缓冲体系以及cDN或其类似物组成。其中，优选的，所述的中性胞苷脂材DNCA的结构式如式I所示：所述的阳离子脂材CLD的结构式如式Ⅱ所示：所述的PEG2000-DSPE结构式如式Ⅲ所示：其中，优选的，所述的金属盐为钙盐，更优选为CaCl2。其中，优选的，所述的cDN包括3′,3′-cGAMP、2′,3′-cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP。其中，优选的，所述cDN类似物包括但不限于化学式Ⅳ所示的RpS-cdG和化学式Ⅴ所示的Rp,Rp-3′,3′-di(2′-F)-cGsAsMP。其中，优选的，所述的混合脂材制剂，是通过以下方法制备得到：将中性胞苷脂材DNCA、阳离子脂材CLD、PEG2000-DSPE溶于乙醇溶液中，将环二核苷酸或其类似物溶于DEPC水中，使用配制好的含有金属盐的PBS混合这些物质，然后超声，得到所述的混合脂材制剂，即为cDN/Mix；其中，优选的，DNCA：CLD：cDN的摩尔比＝10:6:1，PEG2000-DSPE的掺入量占所有脂材的0.5mol％，使用配制好的含有0.1mMCaCl2的PBS混合这些物质。进一步的，本专利技术还提出了所述的混合脂材制剂在单独或与其他本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环二核苷酸(cyclic dinucleotides,cDN)或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂，命名为cDN/Mix，其特征在于，所述的制剂由中性胞苷脂材DNCA、阳离子脂材CLD、PEG2000-DSPE、金属盐/PBS缓冲体系以及环二核苷酸或其类似物组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种环二核苷酸(cyclicdinucleotides,cDN)或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂，命名为cDN/Mix，其特征在于，所述的制剂由中性胞苷脂材DNCA、阳离子脂材CLD、PEG2000-DSPE、金属盐/PBS缓冲体系以及环二核苷酸或其类似物组成。


2.根据权利要求1所述的混合脂材纳米制剂，其特征在于，所述的中性胞苷脂材DNCA的结构式如式I所示：



所述的阳离子脂材CLD的结构式如式Ⅱ所示：



所述的PEG2000-DSPE结构式如式Ⅲ所示：





3.根据权利要求1所述的混合脂材纳米制剂，其特征在于，所述的金属盐为钙盐，优选为CaCl2。


4.根据权利要求1所述的混合脂材纳米制剂，其特征在于，所述的cDN包括3′,3′-cGAMP、2′,3′-cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP。


5.根据权利要求1所述的混合脂材纳米制剂，其特征在于，所述的cDN类似物包括但不限于化学式Ⅳ所示的RpS-cdG和化学式Ⅴ所示的Rp,Rp-3′,3′-di(2′-F)-cGsAsMP；



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【专利技术属性】
技术研发人员：杨振军，于小桐，代宏，孙旭东，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11