一种TIRF照明的深度成像方法和系统技术方案

本发明专利技术公开了一种TIRF照明的深度成像方法和系统，该方法包括：TIRF照明时入射光在待成像样品前发生全反射，并产生倏逝波，产生的倏逝波透射到待成像样品上；改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，STORM成像单元对待成像样品成像，将所有的待成像样品图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品成像图像，实现深度成像。本发明专利技术基于STORM+TIRF的方式，通过不同的TIRF照明，实现一定深度方向的成像。实现一定深度方向的成像。实现一定深度方向的成像。

【技术实现步骤摘要】
一种TIRF照明的深度成像方法和系统


[0001]本专利技术涉及显微成像
，具体涉及一种TIRF照明的深度成像方法和系统。

技术介绍

[0002]STORM属于显微镜成像领域，其原理是当光入射到带有荧光染色的细胞后，细胞会发出随机的荧光闪烁点。通过多次的成像，最终可以得到每个位置的荧光闪烁点，而闪烁点的位置即是细胞的位置点。当光照射到细胞时，因为荧光的随机闪烁，一次一次闪烁后，最终可以得到每个闪烁点的位置，就可以得到细胞的不同位置的图像。即对荧光细胞成像时候，通过荧光分子的随机闪烁过一段时间的图片来将闪烁点重构出来，以实现超分辨的成像。
[0003]TIRF照明属于全反射并产生倏逝波，也就是在全反射时光会在光密介质中内反射，根据物理光学部分，光会在光疏介质中产生薄薄的一层倏逝波。典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm，只有临近盖玻片表面(进场)的荧光分子才能被激发，远场分子不受激发。
[0004]STORM显微镜成像采用TIRF照明产生的倏逝波照射带有荧光染色的细胞，TIRF照明时候可以让照明区域更加薄，使得成像时候的杂散光降低，提高成像的信噪比。但是因为倏逝波仅仅只是薄薄的一层，而且只能贴着靠近光密介质的光疏介质中传播，因此STORM+TIRF的组合无法完成深度的成像。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服以上现有技术存在的不足，提供了一种能实现深度成像的TIRF照明的深度成像方法和系统。
[0006]本专利技术的目的通过以下的技术方案实现：r/>[0007]一种TIRF照明的深度成像方法，包括：TIRF照明时入射光在待成像样品前发生全反射，并产生倏逝波，产生的倏逝波透射到待成像样品上；改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，STORM成像单元对待成像样品成像，将所有的待成像样品图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品成像图像，实现深度成像。
[0008]优选地，一种TIRF照明的深度成像方法包括：
[0009]S1，TIRF照明时入射光的入射角度为θ1，透射深度为H1，通过STORM的荧光成像为S1；
[0010]S2，改变入射角度为θ2，此时透射深度为H2，通过STORM的荧光成像为S2；其中H2>H1；
[0011]S3，计算透射深度H1‑
H2对应的待成像样品图像为S2‑
S1；
[0012]S4，重复改变不同的入射角度，直到得到透射深度H
n
‑
H
n
‑1对应的待成像样品图像S
n
‑
S
n
‑1，实现不同深度的待成像样品成像。
[0013]优选地，入射光的入射角度与倏逝波的透射深度的关系表达式为：
[0014][0015]其中，θ为入射光的入射角度，d为倏逝波的透射深度，n1为TIRF照明中待成像样品前的物镜的折射率，n2为待成像样品的折射率。
[0016]优选地，一种TIRF照明的深度成像方法还包括：对不同深度的倏逝波照明进行亮度补偿，校正因为倏逝波深度导致的成像亮度变化。
[0017]一种TIRF照明的深度成像系统，包括：STORM成像单元和TIRF照明单元；TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品上，STORM成像单元均对待成像样品成像；待成像样品夹持在上玻片和下玻片之间，下玻片和物镜之间填充浸没油，下玻片、浸没油和物镜的折射率相同，且均大于待成像样品的折射率。
[0018]优选地，TIRF照明单元包括：照明光源、中间折返镜和物镜；照明光源发出的激光经中间折返镜反射，再经物镜透射后照射到下玻片上发生全反射，并产生倏逝波照射到待成像样品上。
[0019]优选地，照明光源包括：光纤光源和准直透镜组；光纤光源发出的激光经过准直透镜组后照射到中间折返镜。
[0020]优选地，TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波包括：通过改变TIRF照明单元的动件，来改变入射到待成像样品的入射角，并通过测量动件的移动位置和此时入射到待成像样品上的入射角关系，获得移动位置和入射角的关系曲线。
[0021]优选地，TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品上，STORM成像单元均对待成像样品成像包括：
[0022]步骤一：移动动件到位置L0，倏逝波的深度为d0，此时STORM成像相机聚焦到d0处清晰成像，此时待成像样品成像为S0；
[0023]步骤二：移动动件到L1，对应的倏逝波深度为d0+
△
d，此时倏逝波深度为d1＝d0+
△
d，此时待成像样品成像为S1；其中，
△
d为倏逝波的透射深度进行N等分之后的等分间隔；
[0024]步骤三：移动动件到L2，对应的倏逝波深度为d0+2
△
d，此时待成像样品成像为S3；
[0025]步骤四：继续移动动件，直到动件位置为L
m
，对应的倏逝波深度为d0+m
△
d，移动待成像样品前的物镜，移动距离为m
△
d/n1,此时物镜聚焦在Lm,，此时倏逝波深度为dm＝d0+m
△
d，待成像样品成像为S
m
；
[0026]步骤五：重复步骤二至步骤四，移动动件，直到动件的位置为L
N
时，此时待成像样品成像为S
N
；
[0027]步骤六：将相邻的两幅待成像样品成像依次相减，分别得到
△
S1，
△
S2，
…△
SN，这些相减得到的图形，就是不同深度下的待成像样品图像。
[0028]优选地，动件包括：准直透镜组、光纤光源和照明光源中的任意一种。
[0029]本专利技术相对于现有技术具有如下优点：
[0030]本专利技术在TIRF照明时通过改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，STORM成像单元对待成像样品成像，将所有的待成像样品图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品成像图
像，实现深度成像。因此，本专利技术基于STORM+TIRF的方式，通过不同的TIRF照明，实现一定深度方向的成像。
附图说明
[0031]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0032]图1为本专利技术的TIRF照明的深度成像方法的流程示意图。
[0033]图2为本专利技术的入射光的入射角度与倏逝波的透射深度的关系图。
[0034]图3为本专利技术的深度光强和照明深度的关系图。
[0035]图4为本专利技术的物镜全反射角度、最大孔径角与浸没油、待成像样品的关系图。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TIRF照明的深度成像方法，其特征在于，包括：TIRF照明时入射光在待成像样品前发生全反射，并产生倏逝波，产生的倏逝波透射到待成像样品上；改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，STORM成像单元对待成像样品成像，将所有的待成像样品图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品成像图像，实现深度成像。2.根据权利要求1所述的TIRF照明的深度成像方法，其特征在于，包括：S1，TIRF照明时入射光的入射角度为θ1，透射深度为H1，通过STORM的荧光成像为S1；S2，改变入射角度为θ2，此时透射深度为H2，通过STORM的荧光成像为S2；其中H2&gt;H1；S3，计算透射深度H1‑
H2对应的待成像样品图像为S2‑
S1；S4，重复改变不同的入射角度，直到得到透射深度H
n
‑
H
n
‑1对应的待成像样品图像S
n
‑
S
n
‑1，实现不同深度的待成像样品成像。3.根据权利要求1所述的TIRF照明的深度成像方法，其特征在于，入射光的入射角度与倏逝波的透射深度的关系表达式为：其中，θ为入射光的入射角度，d为倏逝波的透射深度，n1为TIRF照明中待成像样品前的物镜的折射率，n2为待成像样品的折射率。4.根据权利要求1所述的TIRF照明的深度成像方法，其特征在于，还包括：对不同深度的倏逝波照明进行亮度补偿，校正因为倏逝波深度导致的成像亮度变化。5.一种TIRF照明的深度成像系统，其特征在于，包括：STORM成像单元和TIRF照明单元；TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品上，STORM成像单元均对待成像样品成像；待成像样品夹持在上玻片和下玻片之间，下玻片和物镜之间填充浸没油，下玻片、浸没油和物镜的折射率相同，且均大于待成像样品的折射率。6.根据权利要求5所述的TIRF照明的深度成像系统，其特征在于，TIRF照明单元包括：照明光源、中间折返镜和物镜；照明光源发出的激光经中间折返镜反射，再经物镜透射后照射到下玻片上发生全反射，并产生倏逝波照射到待成像样品上...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨乐宝，王宏达，
申请(专利权)人：中科院长春应化所黄埔先进材料研究院，
类型：发明
国别省市：