一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒。本发明专利技术采用五组或五组以上多重PCR体系，结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的49个单核苷酸多态性(SNP)位点。试剂盒组成：用于扩增所述49个SNP位点的引物组合物，PCR反应液和超纯水。检测步骤：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；(2)将上述49个SNP位点分成五组或五组以上，设计五组或五组以上的引物组合物；(3)采用步骤(1)所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；(4)按PCR产物片段长短/质量同步分离49个SNP位点；(5)结果分析判读。本发明专利技术的优势是快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低。成本低。成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]恶性高热(Malignant Hyperthermia，MH)是目前所知的唯一可由常规麻醉用药引起手术死亡的遗传性疾病。在全麻过程中，挥发性吸入麻醉药和去极化肌松药-琥珀胆碱可引起的骨骼肌异常高代谢状态，患者出现高热、酸中毒、低氧血症、高血钾、心律失常等一系列变化，一旦发病，病情发展迅速，在没有特效拮抗药丹曲林的情况下，一般临床措施难以控制病情，最终病人可因器官功能衰竭而死亡。恶性高热在普通人群中的发病率为1/10000～1/250000。由于临床上遇到恶性高热，往往都没有做好预防措施，治疗不及时，致死率高达70％～90％。若患者及时接收治疗并使用特效药丹曲林，致死率可降低到10％以内。
[0003]目前，国际上公认咖啡因-氟烷体外肌挛缩试验(CHCT)是确诊MH易感性的金标准。CHCT价格昂贵，局限于专业测试中心使用，需要外科手术切取患者一块肌肉，创伤性较大，且不容易区分假阳性和假阴性结果，在某种程度上限制了其广泛应用。
[0004]MH作为一种常染色体显性遗传病，研究证实至少有5个基因的异常与其发生有关，但已明确的致病基因仅为罗纳丹受体(Ryanodine receptor，RYR1)和编码二氢吡啶受体α1亚单位的CACNA1S(L type voltage-dependent calcium channel，L型电压门控Ca
2+
>通道)。因此，对于采用全麻麻醉的手术患者，术前通过检测RYR1和CACNA1S基因的突变，筛查恶性高热易感性，可帮助医生调整麻醉方案，有效避免恶性高热发生。通过检测与恶性高热相关的49个SNP位点判断恶性高热易感性，操作方便，成本较低，是一种可行性较高的检测方案。
[0005]现有的SNP位点检测方法主要有三种：荧光定量PCR、基因芯片技术、测序法。现简述如下：
[0006]1、荧光定量PCR：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强；其缺点：
[0007](1)通量低，如同时检测49个SNP位点，需要至少分10个反应管检测，耗时长，样品用量大，难以适应临床需求；
[0008](2)难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性；
[0009](3)探针标记成本高。
[0010]2、基因芯片技术：
[0011]基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。此外，芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。
[0012]3、测序法：
[0013]Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能发现已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂、成本较高、周期长，需要一个一个位点测序，多个SNP位点测序耗时长、累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术还不够成熟。
[0014]由于恶性高热易感基因SNP数量较多，以上技术均具有明显局限性，因此很难应用于恶性高热易感基因检测。
[0015]目前，国内外尚无有关以多重PCR和CE分离技术为基础的恶性高热易感基因检测方案的报道。

技术实现思路

[0016]本专利技术基于多重聚合酶链式反应(PCR)和毛细电泳(CE)分离技术检测，提供了一种快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低的检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒。
[0017]具体地，本专利技术将与恶性高热相关的49个SNP位点分成五组或五组以上，根据分组的SNP位点，采用对应的五组或五组以上的引物组合物，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的49个单核苷酸多态性(SNP)位点。其中，各组引物组合物包含所检测的SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及3个人基因组DNA内参和1个PCR反应内参的正反向扩增引物。所述人类基因组内参基因(huDNA)用于监测样本DNA质量，可避免DNA质量不好而造成的假阴性；PCR反应内参(pcDNA)用于监测PCR反应过程，可避免PCR反应失败造成的假阴性。本专利技术针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中两条引物(即正向引物)分别与野生基因和突变的易感基因互补结合，另一条引物(即反向引物)作为共用引物，分别与野生型引物和突变型引物扩增出长度相差2～10bp的PCR产物片段。
[0018]本专利技术提供了一种检测恶性高热易感基因的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增49个SNP位点的引物组合物、PCR反应液和超纯水。
[0019]本专利技术所采用的PCR反应液包括以下组分：超纯水、2
×
PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
[0020]本专利技术提供的检测恶性高热易感基因的方法步骤如下：
[0021](1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；
[0022](2)将49个SNP位点分成五组或五组以上；设计五组或五组以上的引物组合物；
[0023](3)采用步骤(1)所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；
[0024](4)毛细电泳，按PCR产物片段长短/质量同步分离49个SNP位点；
[0025](5)结果分析判读，根据检测峰图，可获得每个SNP位点的基因型，从而判断恶性高热易感性，如表1所示。
[0026]表1 SNP位点基因型对应临床参考信息
[0027][0028][0029][0030][0031]与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：
[0032]本专利技术所采用的检测方法和试剂盒能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法的缺陷，具有以下优势：
[0033](1)高通量，能实现49个SNP位点的同步检测；
[0034](2)准确性高，采用CE技术对PCR产物进行分离，可将非特异性产物、引物二聚体和特异性产物分离，最大程度降低假阳性；
[0035](3)灵敏度高，本试剂盒能检测含量低至1ng/反应的样品；
[0036](4)使用经济，本专利技术提供的试剂盒检测成本低，利于大规模推广。
附图说明
[0037]图1为一个麻醉手术患者的口腔脱落细胞采集卡样本(样品未经核酸提取直接PCR扩增)的恶性高热易感基因的检测结果。49个SNP位点被分为五组，如表2.1～2.5所示。图
1.A为A组SNP检测结果，无突变；图1.B为B组SNP检测结果，可见RYR1基因的c.7361G＞A位点发生GG
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测恶性高热易感基因的方法，其特征在于，所述方法用于非疾病诊断目的；将与恶性高热易感性相关的49个SNP位点分成五组或五组以上，采用五组或五组以上的引物组合物对样本进行多重PCR扩增，结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的49个SNP位点；所述49个SNP位点如表1所示：表1恶性高热易感性相关的49个SNP位点所述方法包括如下检测步骤：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；(2)将所述49个SNP位点分成五组或五组以上，设计五组或五组以上的引物组合物；(3)采用步骤1所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；(4)按PCR产物片段长短/质量同步分离49个SNP位点；(5)结果分析判读。2.如权利要求1所述的一种检测恶性高热易感基因的方法，其特征在于，检测步骤(1)所述口腔脱落细胞保存于细胞采集卡上，可不需要核酸提取，直接用于PCR扩增。3.如权利要求2所述的一种检测恶性高热易感基因的方法，其特征在于，每组引物组合物中包含用于扩增其对应组的SNP位点、3个人基因组DNA内参和1个PCR反应内参的正反向
引物。4.如权利要求3所述的一种检测恶性高热易感基因的方法，其特征在于，针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中2条引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物与野生型和突变型引物分别扩增出片段长短有2～10个碱基差异的片段。5.一种检测恶性高热易感基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：左云霞，应斌武，吴勇，王凡，刘斌，腾翼，王旻晋，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：