根据染色动力学来检测至少一种微生物的方法和装置以及检测支持物制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种在检测支持物(1,21)上检测存在于待分析样品(3)中的至少一种微生物(2)的方法，所述微生物凭借至少一种细胞标记物(4)来显现。该方法包括在控释所述标记物(4)的步骤之前首先拍摄图像(I0,I

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】根据染色动力学来检测至少一种微生物的方法和装置以及检测支持物
[0001]本专利技术涉及在固相中检测诸如细菌、酵母和霉菌类型等微生物的领域。
[0002]本专利技术主要适用于工业微生物学领域，例如但不限于制药、生物技术、化妆品或食品加工工业，或用于临床或环境微生物学。
[0003]本专利技术更具体地涉及一种用于在合适的支持物上的固相中极早期地检测微生物而无需培养繁殖所述微生物的装置和方法。
[0004]当前实施了许多技术来检测待测样品中的污染物，例如细菌。
[0005]最老且最常规的方法包括：将样品(可选地在过滤后)放置在营养琼脂生长培养基的表面上，该培养基对一种或多种微生物具有或多或少的选择性。
[0006]然后将所述培养基在合适的温度下温育以使所需的微生物生长，通常生长长达数天，而后由操作者“手动”计数肉眼可见的菌落。
[0007]这种方法尽管高度灵敏并且允许在原始样品中检测到单一的活的可培养污染物，但其缺点是需要较长的温育时间才能通过肉眼检测到在琼脂上形成的菌落。
[0008]代替固体琼脂，另一种可行的方法涉及在液体培养基中接种，在温育后，通过例如比浊法来检测其中的微生物生长，由此测得的吸光度与培养基中存在的微生物浓度成比例。
[0009]液相检测技术的缺点是它们无法检测到低于106或107个细胞/mL的微生物浓度。因此，必须将样品再次温育一段可变的时间以达到这种细胞浓度。
[0010]还应注意，在应激(例如热应激)的作用下或由于样品中存在抑制剂，某些微生物可能需要特别长的时间来繁殖，从而进一步延后了使用常规培养技术可以检测到它们的时刻。
[0011]现有技术中的另一种已知方法涉及进行聚合酶链式反应(也称为PCR扩增)来扩增DNA或RNA序列，由此确定样品中特定微生物的存在。
[0012]但是，这些方法的缺点是需要多条核酸链，即样品中的多个污染微生物，通常至少数十个微生物。因此，这样的方法的灵敏度不如基于微生物生长的常规培养技术。
[0013]因此，近年来，为了提高微生物检测速度，同时试图保持常规的基于生长的技术的灵敏度，已经开发并完善了许多方法。
[0014]这些方法大多数都基于检测特定荧光化学物质、荧光团或荧光染料所发出的荧光，利用不同的染色技术将它们与所要检测的微生物的细胞功能或结构(核酸、蛋白、酶等)关联起来。
[0015]这些方法需要实施特定的检测装置，例如用于“DEFT”(直接落射荧光滤光器技术)的显微镜或细胞仪。
[0016]因此，流式细胞术技术现在通常用于检测和计数样品中存在的微生物。
[0017]在这种技术中，可以用荧光团染色并悬浮在液体中的细胞或颗粒以单细胞流的形式被依次逐个分离。然后使它们以高速逐个通过光源，例如来自激光器的光束。
[0018]由细胞漫射和发出的光，在用荧光团染色并在给定波长下激发后的情况下是荧光
性的，并且由构成细胞仪的光学装置的反射镜和滤光镜系统引导至一组光检测器。这些检测器特别地装有光电倍增管，它将光信号转换成电信号，然后可由计算机分析电信号以产生关于例如细胞的物理特征的相关数据。
[0019]当前可商购的流式细胞仪能够每秒实时分析数百个细胞或“事件”，并且其中一些装置可以配置为允许根据光学特性对细胞或颗粒进行分选。
[0020]但是，无论是实施流式细胞术还是显微镜技术，稀有事件的检测往往是复杂的。
[0021]实际上，流式细胞术的灵敏度有限，在最佳情况下，估计其灵敏度为102至103个细胞/mL悬浮液，并且是基质依赖性的。
[0022]在“DEFT”技术中，使待分析的样品通过膜来过滤，该膜保留可能包含在所述样品中的微生物。
[0023]然后将微生物用与DNA或RNA相互作用的荧光染料(例如吖啶橙)染色，然后使用落射荧光显微镜对膜的多个视场进行目视分析来对微生物计数。
[0024]在荧光显微镜检中，为了获得代表性的结果，经估算在直径为25mm的膜上必须存在至少104个细胞，应注意计数仅对膜的一小部分进行(小于总尺寸的10％)，并且细胞的均匀分布是假定的而不是确定的。
[0025]但是，在工业或临床微生物学的某些应用中，对样品中单一污染物或几种污染物存在的早期检测可能特别重要。实际上，在这类工业中制造和/或转化的产品特别敏感，特别是由于其最终目的(食品、消费者保健等)。因此，必须尽量快速地确保其微生物品质无可挑剔，或者，如果不是这种情况，则必须能够快速鉴定污染源。
[0026]特别由于这些原因，近些年开发了固相细胞计数法，也称为激光扫描细胞计数法，其适用于可过滤样品。特别而言，其是欧洲专利文件EP 0713087的主题。
[0027]在该方法中，在合适的膜上过滤样品的第一步之后，潜在地存在于所述膜上的任何微生物都要经过使用荧光团染色的步骤。
[0028]然后，通过激光束扫描膜的整个表面，以激发荧光团，并通过测量发射的荧光来计数待分析的原始样品中潜在存在的任何活的微生物。
[0029]名为ChemScan RDI(注册商标)的装置用于执行这种固相细胞计数法。
[0030]然而，当前可商购的用于执行固相细胞计数技术的装置以及必需的试剂特别昂贵并且需要大量投资。结果，并非所有实验室都可以使用此技术。
[0031]而且，一旦进行了微生物的检测和计数，所用试剂对细胞代谢的毒性作用能够阻碍用于鉴定所述微生物的后续培养。
[0032]还应注意，这种固相细胞计数法仅适用于可过滤的基质，从将样品放置到固体支持物上到获得存在于所述固体支持物上的微生物的计数结果所需的时间是相对较长的，实际上，根据应用，该所需时间经估计至少为90分钟，且最长可达4小时。
[0033]最后，无论是使用流式细胞术还是固相细胞计数技术，检测到的假阳性率仍然相对较高。实际上，非微生物的惰性颗粒(例如灰尘)也可能发出自然荧光，或者甚至与荧光染料结合以发出干扰性荧光。
[0034]这构成了迄今为止的现有方法的真实缺陷：根据应用领域，被证明是假阳性的样品需要进一步检查，这些检查是非常耗时的，并且还能够产生显著的财务影响，特别是在上述检查期间必须关闭生产线(例如，生物制药的生产线)的情况下。
[0035]通常，用荧光团进行细胞染色的方法需要由合格的人员来处理样品，并且要求处理荧光试剂以使其与待检测的微生物接触，这不可避免地产生污染样品的风险。
[0036]还应该注意的是，所有这些操作以及在样品制备前进行的工作(特别包括过滤、活化、染色和洗涤等)，都不可避免地需要操作人员花费大量的处理时间，这同样地延迟了检测到潜在污染的时间。
[0037]本专利技术提出一种用于极早地(在必要时几乎瞬时地)检测在待分析的原始样品中潜在地存在的一种或多种微生物的方法和装置，由此提供了至少部分地克服现有技术的各种上述缺点的可能性。
[0038]本专利技术的方法和装置基于利用以受控方式递送的细胞标记物来检测和分析潜在微生物的染色动力本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在固体检测支持物(1,21)上检测存在于待分析样品(3)中的属于细菌、酵母或霉菌类型的至少一种微生物(2)的方法，所述微生物凭借至少一种细胞标记物(4)来显现，所述方法的特征在于其至少包括以下步骤，依次为：a)将所述待分析样品(3)放置在所述固体检测支持物(1,21)上；b)用能够显现出所述至少一种细胞标记物(4)的光辐射(6)来照射所述检测支持物(1)至少一次；c)利用光学成像装置(7)，以至少10mm长乘以至少10mm宽的视场为目标，采集所述检测支持物(1,21)的至少一部分上的所述样品(3)的第一阶段P0中的至少一个图像(I0)；d)通过所述检测支持物(1,21)进行所述至少一种细胞标记物(4)的受控释放，从而使所述标记物(4)与所述微生物(2)接触；e)在所述标记物(4)的受控释放步骤之后，在至少一个后续阶段Pi中，利用所述光学装置(7)对所述检测支持物(1,21)的已在P0阶段采集过图像的每个部分采集图像(I
i
)(i≥1)，从而根据所述微生物(2)的染色动力学的变化来检测所述至少一种微生物(2)；f)对于所述检测支持物(1,21)的每个部分，在P0采集的所述图像(I0)和至少一个后续阶段P
i
采集的每个图像(I
i
)之间进行比较分析，并得出在所述样品(3)中是否存在至少一种微生物(2)的结论。2.如前一权利要求所述的检测方法，其特征在于，每次在P0、P
i
采集图像时，用光辐射(6)局部地照射所述检测支持物(1,21)。3.如前述权利要求中任一项所述的检测方法，其特征在于，其至少包括以下步骤，依次为：a1)将所述待分析样品(3)放置在所述固体检测支持物(1,21)上；b1)用能够显现出所述至少一种细胞标记物(4)的光辐射(6)来局部地照射所述检测支持物(1,21)；c1)与照射步骤b1)同时地，利用光学成像装置(7)，以至少10mm长乘以至少10mm宽的视场为目标，采集所述检测支持物(1,21)的至少一部分上的所述样品(3)的第一阶段P0中的至少一个图像(I0,I
’0)；d1)通过所述检测支持物(1,21)进行所述至少一种细胞标记物(4)的受控释放，从而使所述标记物(4)与所述微生物(2)接触；e1)在所述细胞标记物(4)的受控释放步骤d1)后少于5秒的时间内，用能够显现出所述至少一种细胞标记物(4)的所述光辐射(6)来局部地照射所述检测支持物(1,21)；f1)与照射步骤e1)同时地，在所述标记物(4)的受控释放步骤之后，在至少一个后续阶段P1中，利用所述光学装置(7)对所述检测支持物(1,21)的已在P0阶段采集过图像的每个部分采集图像(I1,I
’1)；g1)用所述光辐射(6)再次局部地照射所述检测支持物(1,21)至少一次；h1)与照射步骤g1)同时地，在至少一个第二后续阶段P2中，利用所述光学装置(7)对所述检测支持物(1,21)的已在P0和P1阶段采集过图像的每个部分采集图像(I2,I
’2)，从而根据所述微生物(2)的染色动力学的变化来检测所述至少一种微生物(2)；i1)对于所述检测支持物(1,21)的每个部分，在P0采集的所述图像(I0、I
’0)和至少两个后续阶段P1和P2采集的所述图像(I1,I
’1；I2,I
’2)之间，进行比较分析，并得出在所述样品
(3)中是否存在至少一种微生物(2)的结论。4.如前述权利要求中任一项所述的检测方法，其特征在于，沿着不同的路径使所述检测支持物(1,21)经历n次位移，以将所述检测支持物(1,21)在空间上划分成n+1个部分，在至少两个阶段P0和P
i
中采集其图像，其中n是小于或等于20的整数。5.如前述权利要求中任一项所述的检测方法，其特征在于，在图像采集步骤c)和e)或c1)、f1)和h1)中，使用分辨率至少等于20百万像素、优选大于100百万像素的光学成像装置(7)。6.如前述权利要求中任一项所述的检测方法，其特征在于，如果在步骤f)或i1)中得出的结论是所述样品(3)中存在至少一种微生物(2)，则对所述样品(3)中存在的微生物(2)进行计数。7.如前述权利要求中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述细胞标记物(4)是荧光标记物。8.如前述权利要求中任一项所述的检测方法，其特征在于，在步骤d)或d1)中以受控方式释放的所述细胞标记物(4)包封在包封元件(8)中。9.如前一权利要求所述的检测方法，其特征在于，所述细胞标记物(4)以固体形式、例如以粉末形式包封在包封元件(8)中，并且所述检测支持物(1)包含用于溶解所述标记物(4)的溶剂。10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述细胞标记物(4)以液体形式包封。11.如权利要求8至10中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述包封元件(8)是热敏的，并且在步骤d)或d1)中，包封在所述热敏包封元件(8)中的细胞标记物(4)的受控释放通过以下方式来进行：使所述热敏包封元件(8)经受能够熔化所述热敏包封元件(8)的温度升高。12.如前一权利要求所述的检测方法，其特征在于，将温度从环境温度升高到45℃的最高温度。13.如权利要求1至7中任一项所述的检测方法，其特征在于，将液体溶液中的细胞标记物(4)以受控方...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：红莓，
类型：发明
国别省市：