一种基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，属于微流控技术在生物学领域的应用。本发明专利技术基于利用微生物微滴培养的方式进行菌种驯化与筛选；所述微生物微滴培养的方式，是通过高通量微生物液滴培养设备来实现，通过在设备微流控芯片中形成微液滴单元，进行在线连续培养，并在其过程中可更换不同浓度的化学因子培养基实现菌种驯化，最终通过菌种OD筛选，挑出最优微液滴单元并提取。挑出最优微液滴单元并提取。

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法


[0001]本专利技术属于微流控技术在微生物培养领域的应用，特别涉及一种基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法。

技术介绍

[0002]菌种驯化是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法。通常的手段是利用摇瓶培养方式对菌种进行多次传代，在菌种传代过程中增加其生长压力（通常是某些化学因子），最终得到能够耐受高生长压力的菌种。
[0003]整个驯化过程无法实现完全自动化，人工传代过程中非常容易染菌，菌种的传代操作和生长情况的监测会耗费大量人力，并且检测需要进行取样操作，由于样品量的限制，无法进行密集检测，获得的数据量非常有限。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法。该方法具有简单、方便、高效、经济、实用特点，特别实用于细菌、酵母、孢子等微生物驯化与筛选。
[0005]本专利技术通过如下技术方案实现：一种基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，使用微生物微滴培养的方式进行菌种驯化与筛选，所述微生物微滴培养的方式是利用高通量微生物液滴培养设备来实现，即通过在设备微流控芯片中形成微液滴单元，进行在线连续培养，并在其培养过程中更换不同浓度的化学因子培养基实现菌种驯化，最终通过菌种OD筛选，挑出最优微液滴单元并提取。
[0006]所述高通量微生物液滴培养设备由进样系统、微流控芯片系统、控温系统、液滴识别系统、液滴检测系统以及控制系统组成，根据专利201920419054. X或201910252767.6制备的产品，可以实现通过微流控芯片装载数百个体积在0.5~10 μL 含有微生物的微液滴，通过在线连续培养、检测和分选，完成微生物选育。
[0007]所述高通量微生物液滴培养设备中微流控芯片容纳1-200个微液滴单元，每个微液滴单元体积为2-3μL。
[0008]进一步，所述高通量微生物液滴培养设备中微流控芯片容纳20-200个微液滴单元，每个微液滴单元体积为2-3 μL。
[0009]对所述微液滴单元检测波长为600 nm，对微液滴单元波长的检测是通过高通量微生物液滴培养设备可以实现液滴检测系统的光纤、光谱仪实现的，光纤光谱仪检测波长为350-800 nm。在本专利技术中，涉及到菌种驯化，通常检测菌种生长状态，常常测定600nm波长下吸光值，进而检测微生物在生产过程中的微生物量OD值。
[0010]所述微生物微滴培养的方式为在线连续培养，在线连续培养时间不做限制，优选0.5-15天或1-100代。
[0011]所述一种基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，包括如下步骤：
1）从微生物菌种生长的固体平板上挑取新活化的单菌落接种至液体培养基，振荡培养至对数生长期；2）将步骤1）获得的菌液接种于新鲜液体培养基中，接种量通常在5%-10%；3）将步骤2）获得的接种量为5%-10%含有菌液的培养基装入高通量微生物液滴培养设备的菌液进样瓶中；4）利用高通量微生物液滴培养设备，进行菌种“生长曲线”在线测定，得到微液滴单元中菌种的完整生长曲线及数据；5）将2种不同浓度化学因子的液体培养基分别装入2个培养基进样瓶中；驯化过程中高通量微生物液滴培养设备将2个培养基进样瓶中的培养基按不同比例混合，用于连续培养、多次传代过程中按化学因子浓度梯度更换培养基；6）设置高通量微生物液滴培养设备“适应性进化”参数：液滴数量、OD基准波长、化学因子浓度、传代方式、传代参数、梯度重复次数，然后开始驯化培养，利用高通量微生物液滴培养设备自动绘制的数据曲线；7）驯化完成后，根据利用高通量微生物液滴培养设备自动绘制的数据曲线，挑选OD最优的微液滴单元进行提取，或进一步将微液滴单元菌株进行摇瓶培养验证。
[0012]所述步骤1）中，振荡培养至对数生长期，通过生长曲线测定，菌种培养至对数生长期，其活性最高，易于后续实验操作。
[0013]所述步骤2）和步骤3）中，接种量为5%-10%，以提供较合适的生长浓度。
[0014]所述步骤4）中，利用高通量微生物液滴培养设备进行在线生长曲线测定，在此过程中，进行微生物微液滴的生成与培养，测定菌种达到对数生长中后期的时间或对数生长中后期的OD值，为步骤6）菌种驯化与筛选的“传代参数”提供参考依据。
[0015]所述步骤5）中，所述利用高通量微生物液滴培养设备将2个培养基进样瓶中的培养基按不同比例混合，是以2个不同浓度化学因子的液体培养基，根据不同比例混合，中间浓度介于2个进样瓶中的培养基的化学因子浓度之间；设备优选1-8个浓度梯度数据即连初始和最终浓度在内，最多能实现8个浓度梯度。
[0016]所述步骤6）中，按照高通量微生物液滴培养设备界面进行参数数值输入：液滴数量为1-200，优选20-200，进一步优选30-100，进一步优选30-80，进一步优选50；OD基准波长，为步骤4）中在线生长曲线测定最佳OD值；化学因子浓度，为起始培养基化学因子含量；传代方式与传代参数，按时间或者OD进行选择，若选择时间，则传代参数中填入的参数为小时数，若选择OD，则传代参数中填入的参数为OD值；梯度重复次数，为每个梯度重复试验次数。在此过程中，要进行微生物液滴、不同化学因子浓度梯度更换培养基液滴的生成、微生物液滴的分割及其与不同化学因子浓度梯度更换培养基液滴的融合，及融合后微生物新液滴的培养。
[0017]所述步骤7）中，挑选OD最优的微液滴单元进行提取，所述提取为通过高通量微生物液滴培养设备的芯片自动进行液滴筛选排出操作，取出OD最优液滴或将进一步进行摇瓶培养验证。
[0018]本专利技术能够大幅度降低菌种驯化过程中人工操作的工作量，并且对驯化全过程中菌种的生长情况进行完整记录，比常规的人工操作可靠性更高；在线进行无损检测，无需取样，对菌株生长环境无影响，且数据更加密集，可以更真实的反应菌株的生长情况；传代过
程在封闭的液滴体系下自动进行，通过高精度注射泵控制，实验的平行性更好，且不易染菌。
附图说明
[0019]图1 为本专利技术利用高通量微生物液滴培养设备“生长曲线”功能设置界面图；图2 为本专利技术利用高通量微生物液滴培养设备“适应性进化”功能设置界面图；图3 为本专利技术利用高通量微生物液滴培养设备“适应性进化”功能中的化学因子浓度选择界面图；图4 为本专利技术利用高通量微生物液滴培养设备“适应性进化”功能中的液滴筛选界面图；图5 为本专利技术大肠杆菌驯化过程中液滴培养单元生长曲线图；图6 为本专利技术酿酒酵母驯化过程中液滴培养单元生长曲线图；图7为本专利技术植物乳杆菌驯化过程中液滴培养单元生长曲线图。
具体实施方式
[0020]为了更好的理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，其特征在于，使用微生物微滴培养的方式进行菌种驯化与筛选，所述微生物微滴培养的方式是利用高通量微生物液滴培养设备来实现，即通过在设备微流控芯片中形成微液滴单元，进行在线连续培养，并在其培养过程中更换不同浓度的化学因子培养基实现菌种驯化，最终通过菌种OD筛选，挑出最优微液滴单元并提取。2.根据权利要求1所述的基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，其特征在于，所述高通量微生物液滴培养设备由进样系统、微流控芯片系统、控温系统、液滴识别系统、液滴检测系统以及控制系统组成。3.根据权利要求2所述的基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，其特征在于，所述高通量微生物液滴培养设备中微流控芯片容纳1-200个微液滴单元，每个微液滴单元体积为2-3μL。4.根据权利要求3所述的基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，其特征在于，所述高通量微生物液滴培养设备中微流控芯片容纳20-200个微液滴单元，每个微液滴单元体积为2-3 μL。5.根据权利要求4所述的基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，其特征在于，对所述微液滴单元检测波长为600 nm。6.根据权利要求1所述的基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，其特征在于，所述微生物微滴培养的方式为在线连续培养。7.根据权利要求6所述的基于微流控技术的菌种驯化与筛选方法，其特征在于，所述在线连续培养为0.5-15天或1-100代。8.根据权利要求1-7...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立言，郭肖杰，张乐乐，
申请(专利权)人：洛阳华清天木生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：