KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用。该引物探针组包括：检测KRAS基因突变的引物对；检测突变型KRAS基因的突变型探针，包括G12D探针、G12V探针、G12S探针、G12C探针、G12A探针、G12R探针和G13D探针；以及检测野生型KRAS基因的野生型探针。申请人通过研究发现，上述引物对扩增的特异性和效率都比较高，并且有较高的灵敏度。因此针对7个突变位点设计相应的检测探针，将所有突变位点的检测置于同一体系中，配合使用特异性引物和特异性探针，根据检测结果对有无突变做出判断，实现对KRAS基因突变的高灵敏度检测，同时有效兼顾了检测成本问题。兼顾了检测成本问题。

【技术实现步骤摘要】
KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用


[0001]本申请涉及分子诊断
，尤其是涉及KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]RAS基因编码的RAS蛋白分子量为21kD，主要位于细胞膜内侧，是具有GTPase活性的信号转导蛋白。RAS蛋白作为不可或缺的分子开关，在信号转导通路中发挥至关重要的作用。一般情况下RAS蛋白与GDP结合处于非激活状态，当胞外信号传递至胞内(如EGF配体和受体结合)时，RAS则以与GTP结合的形式存在，激活丝苏氨酸激酶级联放大效应，从而进一步激活下游的信号转导通路。然而，KRAS基因发生突变后，表达的RAS蛋白为GAP非敏感型，抑制RAS与GAP反应，引起RAS的持续活化，不断地与GTP结合使下游的RAF
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MEK
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ERK通路持续激活，导致细胞持续生长并阻止细胞凋亡。
[0003]RAS基因家族中与人类肿瘤相关的有三种，HRAS、KRAS和NRAS。其中，KRAS基因对于人类肿瘤的影响最大。KRAS基因定位于人12号染色体短臂(12p12.1)，长约35kb，其mRNA由6个外显子组成。研究表明，KRAS基因突变见于90％的胰腺癌、35％～40％的结直肠癌及20％的非小细胞肺癌患者。KRAS基因突变多为点突变，主要集中在2号外显子第12、13、59、61密码子和4号外显子的第117、146密码子。其中第12密码子G12D、G12V、G12C、G12S、G12A、G12R和13密码子G13D这7种热点突变占KRAS基因突变的90％以上。
[0004]表皮生长因子受体(EGFR)是目前肿瘤靶向治疗的主要作用靶点。EGFR的靶向药物包括EGFR单克隆抗体药西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼。然而，肿瘤组织发生KRAS基因突变的肿瘤患者对此类靶向药物完全耐药。美国国立综合癌症网络(NCCN)明确指出：所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态，并且不建议KRAS基因突变的非小细胞肺癌患者使用特罗凯进行分子靶向治疗。可见，KRAS基因突变的检测对于提高癌症治疗的针对性具有重要意义。
[0005]目前，基因突变检测的金标准是Sanger测序法，该技术的优点是实验方法简单，结果直观可靠，成本较低。经过几十年的临床应用，已经得到广大医务人员的认可，但其检测灵敏度较低，且检测周期较长。此外，还有几种可用方法：如高分辨率熔解曲线(high
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resolution melting，HRM)，该方法是通过饱和染料结合于PCR扩增产物监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，其灵敏度在5％左右；扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)，此方法根据引物3
′
端末位碱基必须与其模板DNA链互补才能进行有效的扩增的原理，设计针对基因突变位点的引物序列，从而检测突变基因，其灵敏度在1％左右；以及数字PCR方法，虽然数字PCR的灵敏度能达到0.01％，但是数字PCR系统成本高昂，通量有限，操作繁琐，并且目前qPCR的灵敏度也能够很好的满足需求，故现阶段数字PCR平台并未普及。这些方法都有各自的不足，使得目前在临床上对于KRAS基因突变的检测应用仍不理想，无法同时兼顾检测成本和灵敏度问题。

技术实现思路

[0006]本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种成本低、灵敏度高的KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用。
[0007]本申请的第一方面，提供KRAS基因突变检测的引物探针组，该引物探针组包括：
[0008]检测KRAS基因突变的引物对：
[0009]上游引物：5'
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CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC
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3'(SEQ ID No.1)，
[0010]下游引物：5'
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TCTATTGTTGGATCATATTCGTCCAC
‑
3'(SEQ ID No.2)；
[0011]检测突变型KRAS基因的突变型探针，包括：
[0012]检测KRAS基因第12密码子G12D突变的G12D探针：5'
‑
TACGCCATCAGCTC
‑
3'(SEQ ID No.5)，
[0013]检测KRAS基因第12密码子G12V突变的G12V探针：5'
‑
TACGCCAACAGCTC
‑
3'(SEQ ID No.6)，
[0014]检测KRAS基因第12密码子G12S突变的G12S探针：5'
‑
TACGCCACTAGCTC
‑
3'(SEQ ID No.7)，
[0015]检测KRAS基因第12密码子G12C突变的G12C探针：5'
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TACGCCACAAGCTC
‑
3'(SEQ ID No.8)，
[0016]检测KRAS基因第12密码子G12A突变的G12A探针：5'
‑
TACGCCAGCAGCTC
‑
3'(SEQ ID No.9)，
[0017]检测KRAS基因第12密码子G12R突变的G12R探针：5'
‑
TACGCCACGAGCTC
‑
3'(SEQ ID No.10)，
[0018]检测KRAS基因第13密码子G13D突变的G13D探针：5'
‑
TACGTCACCAGCTC
‑
3'(SEQ ID No.11)；
[0019]检测野生型KRAS基因的野生型探针，包括：5'
‑
TACGCCACCAGCTC
‑
3'(SEQ ID No.12)。
[0020]根据本申请实施例的引物探针组，至少具有如下有益效果：
[0021]引物会影响扩增片段的长度，而不同扩增长度又对检测灵敏度有一定影响，同时不同引物的扩增效率也不相同。申请人通过研究发现，上述引物对扩增的特异性和效率都比较高，并且有较高的灵敏度。同时，由于KRAS基因的第12第13密码子一般至多只会发生一个位点突变，因此针对7个突变位点设计相应的检测探针，通过与野生型探针进行比对，将所有突变位点的检测置于同一体系中，配合使用特异性引物和特异性探针，根据检测结果对有无突变做出判断，实现对KRAS基因突变的高灵敏度检测。另外，在检测时可以采用常规的qPCR方法，有效兼顾了检测成本问题。
[0022]在本申请的一些实施方式中，野生型探针和/或突变型探针进行了锁核酸修饰。锁核酸(LNA)是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2'
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O，4'
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C
‑
亚甲基
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.KRAS基因突变检测的引物探针组，其特征在于，包括：检测KRAS基因突变的引物对：上游引物：5'
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CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC
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3'，下游引物：5'
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TCTATTGTTGGATCATATTCGTCCAC
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3'；检测突变型KRAS基因的突变型探针，包括：检测KRAS基因第12密码子G12D突变的G12D探针：5'
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TACGCCATCAGCTC
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3'，检测KRAS基因第12密码子G12V突变的G12V探针：5'
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TACGCCAACAGCTC
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3'，检测KRAS基因第12密码子G12S突变的G12S探针：5'
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TACGCCACTAGCTC
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3'，检测KRAS基因第12密码子G12C突变的G12C探针：5'
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TACGCCACAAGCTC
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3'，检测KRAS基因第12密码子G12A突变的G12A探针：5'
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TACGCCAGCAGCTC
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3'，检测KRAS基因第12密码子G12R突变的G12R探针：5'
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TACGCCACGAGCTC
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3'，检测KRAS基因第13密码子G13D突变的G13D探针：5'
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TACGTCACCAGCTC
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3'；检测野生型KRAS基因的野生型探针，包括：5'
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TACGCCACCAGCTC
‑
3'。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述野生型探针和/或所述突变型探针进行了锁核酸修饰；优选的，所述G12D探针的第5、7、8个碱基进行了锁核酸修饰，所述G12V探针的第4、7、8个碱基进行了锁核酸修饰，所述G12S探针的第7、8个碱基进行了锁核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张核子，陈伟虹，卢晓萍，操利超，张付瑶，丁世涛，
申请(专利权)人：权利要求书二页说明书八页序列表三页，
类型：发明
国别省市：