MASP-2晶体结构及其用途制造技术

本发明专利技术涉及ＭＡＳＰ－２多肽的晶体及其用途。本发明专利技术公开了ＭＡＳＰ－２晶体可用于测定ＭＡＳＰ－２多肽，包含有催化活性的ＭＡＳＰ－２多肽以及酶原ＭＡＳＰ－２多肽的三维结构。本发明专利技术公开了所述三维结构可用于鉴定能够与ＭＡＳＰ－２相互作用和／或抑制ＭＡＳＰ－２的活性的化合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含MASP-2的催化结构域的多肽的晶体。此外，本专利技术涉及所述晶体在用于鉴定能够与MASP-2相互作用的化合物和/或能调节MASP-2的活性的的化合物的in silico筛选方法中用途。
技术介绍
补体系统是脊椎动物的内在免疫力的重要因素。其能够识别并消除入侵病原微生物并通过调理作用和裂解改变宿主细胞。补体是复杂的级联系统，其中丝氨酸蛋白酶以严格的顺序互相活化。根据我们目前的知识，补体系统的活化可通过三种独立途径启动经典、外源凝集素和旁路途径。经典和外源凝集素途径的第一个组分就是超分子酶复合体，其由识别亚基和相关丝氨酸蛋白酶组成(Gál and Ambrus，2001)。经典途径的识别亚基是C1q，其类似于由N末端胶原样臂和C末端球状头组成的六枝郁金香的花束。球状头结合活化物结构，其导致与胶原样区域相结合的丝氨酸蛋白酶酶原(C1r和C1s)的活化。一个C1q连同C1r和C1s蛋白酶(C1s-C1r-C1r-C1s)的异源四聚体形成C1复合体(Arlaud et al.，1987；Schumaker et al.，1987)。经典途径中的第一个酶事件是C1r酶原的自主活化。活化的C1r随后切割酶原C1s，C1s随后切割并活化C3-转化酶复合体的组分C2和C4。外源凝集素活化途径的启动复合体表面上类似C1复合体。外源凝集素识别亚基甘露糖结合型外源凝集素(MBL)具有C-末端球状C-类型外源凝集素结构域和N-末端胶原样茎(Turner，1996)。MBL能结合病原表面的碳水化合物阵列并通过相关的丝氨酸蛋白酶激发补体级联的活化。有三种丝氨酸蛋白酶，甘露糖结合型外源凝集素-相关的丝氨酸蛋白酶-1，-2和-3(MASP-1/-2/-3)(Thiel et al.，1997；Matsushita et al.，2000；Dahl et al.，2001)和与MBL相关的小的非酶蛋白MAp-19(Stover et al.，1999；Takahashi et al.，1999)。关于MBL-MASP复合体的结构和功能有许多开放性问题。已经证实就MBL的寡聚物状态(从两个三聚体亚基到六个)以及与其相关联的MASP的数量和类型而言存在不同的MBL-MASP复合体(Dahl et al.，2001；Thielens et al.，2001)。最近的证据表明，和C1r与C1s不同，MASP-1和MASP-2可独立作用，它们不形成寡聚物且不需要对方即可活化。MASP-1和MASP-2可自发活化，活化的丝氨酸蛋白酶显示对不同底物的明显活性(Ambrus et al.，2003)。MASP-2是C1s-样酶，裂解C4和C2(Thiel et al.，1997；Rossi et al.，2001)。但与C1s不同，MASP-2可自发活化并由此激发补体级联而无需其它蛋白酶的作用(Vorup-Jensen et al.，2000)。显示两个MBL亚基和两个MASP-2分子组成的复合体代表最小补体固定型亚基(Chen andWallis，2001)。因此MASP-2二聚体可执行C1复合体中C1r2C1s2四聚体介导的所有功能。C1r，C1s，MASP-1/-2/-3酶形成具有共同模块结构的蛋白酶家族(Sim andLaich，2000；Volanakis and Arlaud，1998；Schwaeble et al.，2002)。这些酶的N-末端作用区含有由两个CUB结构域包围的EGF样结构域。C-末端催化区含有位于两个补体控制蛋白(CCP)之后的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域(也称SCR或sushi)模块。最近，MASP-2的CCP1-CCP2-SP，CCP2-SP和SP片段被表达并定性(Ambrus et al.，2003)。SP结构域对于自主活化而言足够并可与完整分子一样有效裂解C2底物。但对于有效的C4裂解，CCP2模块的存在是必要的。CCP2模块可含有C4分子的其它底物结合位点。因此CCP2-SP片段可被认为是MASP-2的催化结构域。X-线晶体学研究已经显示了酶原C1r的催化区(CCP1-CCP2-SP)(Budayova-Spano et al.，2002a)以及酶原和活化的C 1r(Budayova-Spano et al.，2002b)及活化的C1s(Gaboriaud et al.，2000)的催化区(CCP2-SP)的结构。最近的C1s的N-末端CUB1-EGF片段(Gregory et al.，2003)结构以及大鼠MASP-2的CUB1-EGF-CUB2片段(Feinberg et al.，2003)已经公开。然而，没有关于任何MASP的催化结构域的信息在文献中可得。
技术实现思路
关于MASP蛋白的催化结构域的3D结构的信息将促进鉴定能与MASP蛋白反应的有用的化合物。例如关于活性和非活性MASP的催化结构域的3D结构的信息是有用的。具体地，MASP蛋白的调节物，诸如抑制物可以利用MASP蛋白催化结构域的3D结构的信息来设计。尽管在技术上有一些困难，专利技术人成功制备了MASP蛋白的片段的晶体并揭示了其结构。由此，本专利技术的一个目的是提供包含来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个连续氨基酸的多肽的晶体。所述多肽具有催化活性，或所述多肽不具有催化活性。MASP-2的3D结构的信息可用于鉴定能够与MASP-2反应的化合物，例如in silico筛选方法可以用于鉴定很可能与MASP-2反应的化合物。本专利技术另一目的是提供鉴定能与包含来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个连续氨基酸的多肽反应的化合物的方法，其中所述方法包括以下步骤i)提供用于产生分子和分子复合体的三维构象的计算机系统，其中所述计算机系统包括机器可读数据存储介质，包括编码有机器可读数据的数据存储材料，其中所述数据包括含有来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个连续氨基酸的多肽的结构坐标；工作存储器，其存储用于加工所述机器可读数据的指令；与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件将所述机器-可读数据处理为所述三维图像；和与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器；和ii)在计算机上执行指令用于从所述多肽的晶体的结构坐标产生所述多肽的三维图像，使得计算机将包含所述多肽的分子3D模型的结构坐标的计算机可读数据载入其记忆；iii)产生一或多种受试化合物的分子模型；iv)从所述分子模型计算一或多种可能的分子复合体，其可通过将所述多肽与所述一或多种受试化合物相结合而形成；v)产生输出数据，其指示相互作用的程度和/或所述相互作用的位置和/或方向；vi)选出能与所述多肽反应的化合物。本专利技术还包括可利用另一组数据重复的方法，所述数据包含含有来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个连续的氨基酸的另一种多肽的结构坐标。所述方法具体可利用一种催化活性MASP-2多肽和一种缺乏催化活性的MASP-2多肽重复，例如一种双链形式的MASP-2多肽和一种单链形式的MASP-2多肽。因此，所述方法可包括选择仅仅能与催化活性MASP-2反应的化合物，或仅仅能与缺乏催化活性的MASP-2反应的本文档来自技高网...

【技术保护点】
多肽的晶体，所述多肽包含来自ＭＡＳＰ－２的丝氨酸蛋白酶结构域的至少１５０个连续氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】DK 2003-9-5 PA 2003 01282;US 2003-11-21 60/523,6011.多肽的晶体，所述多肽包含来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个连续氨基酸。2.权利要求1的晶体，其中所述多肽包含丝氨酸蛋白酶结构域。3.权利要求2的晶体，其中所述多肽还包含MASP-2的CCP-2结构域。4.权利要求1或2的晶体，其中MASP-2是SEQ ID 1所示的人MASP-2或其功能同源物，其中所述功能同源物具有与SEQ ID 1至少70％相同的序列。5.权利要求1的晶体，其中所述多肽包含SEQ ID 1的氨基酸483-633。6.权利要求1的晶体，其中所述多肽包含SEQ ID 1的氨基酸363-686。7.权利要求1的晶体，其中所述多肽由SEQ ID 1的氨基酸363-686以及至少一个氨基酸的额外肽组成，所述额外肽优选大约4个氨基酸。8.权利要求1的晶体，其中MASP-2是SEQ ID 1所示的人MASP-2，其中氨基酸443-445中的至少一个氨基酸被突变。9.权利要求1的晶体，其中所述晶体衍射X线，从而以下述分辨率测定原子坐标至少5_，优选至少4_，更优选至少3_，更优选至少2.5_，最优选至少2.25_。10.权利要求1的晶体，其中所述晶体包含以下述坐标所示的空间关系排列的原子表3的结构坐标或与表3的结构坐标的标准差不超过2.5_。11.权利要求1的晶体，其中所述晶胞大小为a＝40.950，b＝41.521，c＝102.994，alpha＝96.44，beta＝91.77，gamma＝119.52。12.权利要求1的晶体，其中所述晶体包含以下述坐标所示的空间关系排列的原子表4的结构坐标或与表4的结构坐标的标准差不超过2.5_的坐标。13.制备多肽的晶体的方法，所述多肽包含来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个连续氨基酸，其中所述方法包括以下步骤i)提供所述多肽；ii)可选提供能与所述多肽相互作用的化合物；iii)使晶体在这样的条件下生长，其中所述多肽且可选所述化合物在缓冲液中保温，所述缓冲液包含5-25％的聚乙二醇，0.01M-0.5M的盐，1-10％选自甘油和2-甲基-2，4-戊二醇(penthanediol)组成的组的醇，其中所述缓冲液的pH范围是6-9；；iv)由此制得所述晶体。14权利要求12的方法，其中步骤iii)包含在5-25℃的温度保温。15.权利要求12的方法，其中所述多肽包含CCP-2和MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域。16.权利要求12的方法，其中MASP-2是SEQ ID 1所示的人MASP-2或其功能同源物，其中所述功能同源物具有与SEQ ID 1至少70％相同的序列。17.权利要求16的方法，其中所述多肽包含SEQ ID 1的氨基酸299-686。18.权利要求16的方法，其中所述多肽由SEQ ID 1的氨基酸299-686以及至多20个氨基酸的额外肽组成，所述额外肽优选大约4个氨基酸。19权利要求12的方法，其中MASP-2是SEQ ID 1所示的人MASP-2，其中氨基酸443-445中的至少一个氨基酸被突变。20.权利要求12的方法，其中所述晶体衍射X-线，从而以下述分辨率测定原子坐标至少5_，优选至少4_，更优选至少3_，更优选至少2.5_，最优选至少2.25_。21.鉴定能与包含来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个连续氨基酸的多肽发生反应的化合物的方法，其中所述方法包括以下步骤i)提供用于产生分子和分子复合体的三维图象的计算机系统，其中所述计算机系统包括机器可读数据存储介质，包括编码有机器可读数据的数据存储材料，其中所述数据含有包含来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个氨基酸的多肽的结构坐标；工作存储器，其存储用于加工所述机器可读数据的指令；与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件用于处理所述机器-可读数据存储介质，从而将所述机器可读数据处理为所述的三维图像；和与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器；和ii)在计算机上执行指令用于从所述多肽的晶体的结构坐标产生所述多肽的三维图像，使得该计算机将包含所述多肽的分子模型的结构坐标的计算机可读数据载入其记忆；iii)产生一或多种受试化合物的分子模型；iv)从所述分子模型计算一或多种可能的分子复合体，所述分子复合体可通过将所述多肽与所述一或多种受试化合物相结合而形成；v)产生输出数据，其指示相互作用的程度和/或所述相互作用的位置和/或方向；vi)选出能与所述多肽反应的化合物。22.权利要求21的方法，其中所述方法还包括以下步骤vii)提供至少一种所选的化合物；vii)提供包含来自MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域的至少150个连续氨基酸的多肽；vii)使所述多肽与所选的化合物在可发生相互作用的条件下接触；vii)检测所述多肽与所选化合物之间的相互作用，由此鉴定能与所述多肽反应的化合物。23.权利要求21或22的方法，其中所述多肽包含CCP-2结构域和MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域。24.权利要求21或22的方法，其中MASP-2是SEQ ID 1所示的人MASP-2或其功能同源物，其中所述功能同源物具有与SEQ ID 1至少70％相同的序列。25.权利要求21或22的方法，其中所述多肽包含SEQ ID 1的氨基酸299-686。26.权利要求21或22的方法，其中所述多肽由SEQ ID 1的氨基酸299-686以及至多20个氨基酸的额外肽组成，所述额外肽优选大约4个氨基酸。27.权利要求21或22的方法，其中所述结构坐标是表3所示的坐标，或就保守的蛋白骨架原子而言与表3所示坐标的标...

【专利技术属性】
技术研发人员：维罗尼卡哈马特，彼得盖尔，彼得扎沃德斯基，格扎安布鲁斯，
申请(专利权)人：内蒂穆恩公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]