本发明专利技术涉及一种改进的耐热蜡样芽孢杆菌胶原酶的制备方法，通过引入X到Y个突变对原有蜡样芽孢杆菌胶原酶序列进行改进，所述蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体序列为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7，优选得到突变体序列为SEQ ID NO7的酶在保持酶活的同时且热稳定性明显提高，因此具备更好的应用前景。因此具备更好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种改进的耐热蜡样芽孢杆菌胶原酶的制备方法
[0001]本专利技术涉及基因工程和微生物领域，更具体地说是涉及一种改进的耐热蜡样芽孢胶原酶的制备方法，以及它的一些表征。
技术介绍
[0002]胶原酶通常被认为是特异性水解天然胶原蛋白和水溶性变性胶原蛋白的酶。其中微生物胶原酶实际上是一种金属内肽酶，其依靠于Zn
2+
、Ca
2+
等离子发挥活性。与动物胶原酶相比，微生物胶原酶底物种类更广泛；水解底物更彻底，有的微生物胶原酶可以与胶原蛋白的多个位点发生反应，产生大小均匀的5个残基的短肽，但是动物胶原酶只能与胶原蛋白N端3/4处Gly
‑
Leu或Gly
‑
lle肽键发生反应，产生一个3/4肽段和1/4肽段；微生物胶原酶还更容易获得，因为微生物可以将胶原酶分泌到胞外，通过发酵可以大量生产，而动物胶原酶还需要进行组织培养和提取，工序繁琐且成本很高。
[0003]如今，微生物胶原酶在医药领域，食品、皮革等工业有着广泛的应用。其可直接应用于临床治疗，针对掌筋膜挛缩症、青光眼、腰椎间盘突出等疾病有着良好的治疗效果；胶原酶作为制备胶原多肽的主要成分之一，对食品的生产也做出了巨大贡献；胶原酶作为化学加工中的化学试剂替代品在皮革工业中有很多潜在的应用前景。因为它的加入不仅可以生产出质量更好的产品，而且减少了危险和污染化学品的使用。
[0004]科学界已经从一些微生物中纯化出了微生物胶原酶，并且已经克隆了它们的相应基因并对其进行了测序，但我国在微生物胶原酶方面的研究与应用还处于刚刚起步阶段，国内市场依旧依赖大量高价进口胶原酶产品，限制了微生物胶原酶的利用。在理想的情况下工业中使用的胶原酶需要活性高、热稳定性好等特点，从而加快反应速率，减少反应成本，因此提高酶的热稳定性成了研究的热点。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是利用基因工程技术和微生物技术，设计一种改进的耐热蜡样芽孢杆菌胶原酶，提高胶原酶的热稳定性。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用技术方案的主要原理是：1）含有X到Y个突变的蜡样芽孢杆菌胶原酶序列，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体序列为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7，分别包含了8、10、12、15、23、31、39个氨基酸序列突变。
[0007]2）根据权利要求1所述的突变体序列，进一步地，根据同源模型分子能量表得到能量最低，理论上结构最稳定的蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体序列为：SEQ ID NO7。
[0008]3）一种包含蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体序列SEQ ID NO7的原核表达系统载体。
[0009]4）根据权利要求3一种包含蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体的原核表达表达系统载体，其所述原核表达系统为大肠杆菌。
[0010]5）根据权利要求4一种包含蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体的原核表达系统载体，进
一步地，其所述原核表达系统为大肠杆菌；进一步地，其表达载体为pET系列载体。
[0011]6）根据权利要求2
‑
5一种包含蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体序列SEQ ID NO7的原核表达系统载体，其所述原核表达系统为大肠杆菌，表达载体为pET21a载体。
[0012]7）以及利用金属离子亲和层析纯化蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体的方法，具体步骤如下：步骤1：利用Rosetta软件设计好改进后的蜡样芽孢杆菌胶原酶氨基酸序列SEQ ID NO7，通过PCR扩增技术合成蜡样芽孢杆菌胶原酶目的基因，与pET
‑
21a载体组建成为质粒。
[0013]步骤2：利用热激法将目的基因转入大肠杆菌感受态细胞中，利用氨苄青霉素对菌落进行筛选。
[0014]步骤3：将筛选出的含有目的基因的大肠杆菌通过摇床悬浮培养，并在菌体OD
600
值达到0.6
‑
0.8时加入IPTG诱导剂诱导其表达。
[0015]步骤4：以8000 r/min的速度离心收集菌体沉淀并破碎，接着以10000 r/min的速度离心得到上清液。
[0016]步骤5：用超纯水清洗蛋白纯化镍柱，再将5倍柱体积的缓冲液1清洗纯化柱。随后将破碎过滤后的菌液上样到蛋白纯化镍柱。上样结束后，用5倍柱体积的缓冲液2、缓冲液3先后洗涤蛋白纯化柱，最后用缓冲液4洗涤并收集洗脱下来的蛋白液。其中缓冲液1的组成为0.02 M咪唑含0.1 M NaCl，0.02 M Tris
‑
HCl pH=8；缓冲液2的组成为0.05 M咪唑含0.1 M氯化钠，0.02 M Tris
‑
HCl pH=8）；缓冲液3的组成为0.1 M咪唑含0.1 M氯化钠，0.02 M Tris
‑
HCl pH=8；缓冲液4的组成为0.5 M咪唑含0.1 M氯化钠，0.02 M Tris
‑
HCl pH=8。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1）本专利技术选取微生物来源的胶原酶，相比动物来源的胶原酶它水解底物更彻底，更容易获得，而动物胶原酶还需要进行组织培养和提取，工序繁琐且成本很高。
[0018]2）本专利技术采用基因克隆的技术使菌株所产的胶原酶在大肠杆菌的表达系统中进行更为高效的表达。
[0019]3）本专利技术经过基因转化、蛋白的诱导表达、金属离子亲和层析纯化等生物技术得到的胶原酶纯度相对更高。
[0020]4）本专利技术通过引入突变对原有蜡样芽孢杆菌胶原酶序列进行改进，得到了热稳定性较好的胶原酶。
[0021]5）本专利技术纯化出的胶原酶后续可以使用到胶原蛋白的水解中，得到在美容、医药等领域应用很广泛的胶原蛋白多肽，相比酸法碱法水解污染少且安全可靠，而且水解的胶原蛋白还包括了皮革固废物中生皮边角料的胶原蛋白，实现了皮革废弃物的资源化利用。
附图说明
[0022]图1为胶原酶的电泳检测结果。
[0023]图2为改进前后胶原酶的最适温度对比。
具体实施方式
[0024]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但是本专利技术不局限于以下实施例。
[0025]根据同源模型分子能量表得到能量最低，理论上结构最稳定的蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体序列为SEQ ID NO7，故本专利技术各实施例基于序列7实施，含突变序列的蜡样芽孢杆菌胶原酶由PCR扩增技术合成得到。
[0026]本专利技术的实施例中所用培养基及溶液的配置如下：1L LB液体培养基的配制方法：称取10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸出粉溶于1L去离子水。
[0027]1L LB固体培养基的配制方法：称取10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸出粉、6.5 g琼脂溶于1 L去离子水。
[0028]下层分离胶12%（10 mL）：用移液枪吸取去离子水3.4 mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种包含蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体的原核表达系统载体，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQ ID NO7。2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，优选蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体氨基酸序列为：SEQ ID NO7。3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体包含X
‑
Y个突变；其中SEQ ID NO1含8个氨基酸序列突变，SEQ ID NO2含10个氨基酸序列突变，SEQ ID NO3含12个氨基酸序列突变，SEQ ID NO4含15个氨基酸序列突变，SEQ ID NO5含23个氨基酸序列突变，SEQ ID NO6含31个氨基酸序列突变，SEQ ID NO7含39个氨基酸序列突变。4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述原核表达系统为大肠杆菌，表达载体为pET系列载体。5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，表达载体为pET21a载体。6.权利要求1
‑
5任一项所述的载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：通过PCR扩增技术合成氨基酸序列为SEQ ID NO7的蜡样芽孢杆菌胶原酶基因，将前述基因与pET
‑
21a载体组建成为质粒。7.一种改进的耐热蜡样芽孢杆菌胶原酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用热激法将权利要求1
‑
5任一项所述的载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，利用氨苄青霉素对菌落进行筛选，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王学川，王雪莹，何芳芳，甘婷，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：
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