从细胞培养上清液和生物流体分离并纯化微泡的方法技术

本发明专利技术涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。具体地，本发明专利技术提供从细胞培养上清液和生物液体分离并纯化微泡的方法。本发明专利技术还提供微泡的药物组合物，其用于促进或增强伤口愈合、刺激组织再生、改造疤痕组织、调节免疫反应、改变肿瘤细胞的生长和/或可动性、或改变正常细胞的生长和/或可动性。本发明专利技术还提供欲用作诊断试剂的微泡的组合物以及制备所述微泡的组合物的方法。微泡的组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
从细胞培养上清液和生物流体分离并纯化微泡的方法
[0001]分案信息
[0002]本申请是2014年3月12日递交的申请号为201480026884.6、专利技术名称为“从细胞培养上清液和生物流体分离并纯化微泡的方法”的专利技术专利申请的分案申请。


[0003]本专利技术涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。具体地，本专利技术提供从细胞培养上清液和生物液体分离并纯化微泡的方法。本专利技术还提供微泡的药物组合物，其用于促进或增强伤口愈合、刺激组织再生、改造疤痕组织、调节免疫反应、改变肿瘤细胞的生长和/或可动性、或改变正常细胞的生长和/或可动性。本专利技术还提供欲用作诊断试剂的微泡的组合物以及制备所述微泡的组合物的方法。

技术介绍

[0004]微泡是由许多(即使不是全部)体外和体内的细胞类型分泌的并且存在于诸如例如血液、间质液、尿液、唾液和眼泪等生物流体中。微泡是由细胞的原生质膜形成的包含脂质双层的囊泡并且在尺寸上是不均匀的，范围在约2nm至约5000nm。在本文中将形成微泡的细胞称为“宿主细胞”。微泡是囊泡的异质群体并且包括例如外皮层、微粒、微泡、纳米囊泡、脱落囊泡和膜颗粒。
[0005]微泡在它们的膜表面显示出来自于它们的宿主细胞的膜蛋白质，并且还可以在微泡中含有来自于所述宿主细胞的分子，诸如例如mRNA、miRNA、tRNA、RNA、DNA、脂质、蛋白质或感染性颗粒。这些分子可以起因于或者是导入到所述宿主细胞中的重组分子。微泡在细胞间通讯中发挥关键作用，并且可以在体内局部或远侧发挥作用，通过与靶细胞融合、将微泡上和/或中的分子运输到所述靶细胞中而诱导细胞的改变。例如，微泡已经牵连到抗肿瘤逆转、癌症、肿瘤免疫抑制、转移、肿瘤
‑
基质相互作用、血管生成和组织再生。微泡还可以用来诊断疾病，因为已经证明它们携带了多种疾病的生物标志物，包括例如心脏病、HIV和白血病。
[0006]尽管微泡较重要，但是以有用的量分离微泡并同时保存它们的结构和功能的完整性仍然是个问题。传统的工序采用超速离心以从样本中分离微泡。
[0007]例如，美国专利7,807,438公开了一种用于分离丙型肝炎病毒的方法。该方法包含从感染了丙型肝炎病毒(HCV)的个体的血浆分离出称为外来体的颗粒并且从这些外来体颗粒提取RNA。
[0008]在另一个例子中，美国专利申请US20030198642A1公开了来源于抗原呈递细胞中的富集了MHC II类的隔室的[外]来体
……
[以用于]……
接种赋形剂。
[0009]在另一个例子中，美国专利申请US20060116321A1公开了用于在介导免疫抑制反应中使用的方法和组合物。该组合物
…
包含具有免疫抑制活性的外来体。此种外来体可以来源于各种不同的细胞类型，包括抗原呈递细胞，诸如树突状细胞和巨噬细胞。在分离外来体之前，所述细胞可以经基因工程化以表达能够增强所述外来体的免疫抑制活性的分子
和/或暴露于一种或多种试剂(诸如细胞因子或细胞因子抑制剂)，所述试剂也能够增强外来体的免疫抑制活性。本专利技术还涉及此种外来体用于治疗与免疫系统的不希望的活化有关的疾病和病症的用途。本专利技术还包括从血清中分离的已经证明具有免疫抑制性的外来体。
[0010]超速离心可能损伤微泡，导致囊泡的裂解或破裂。如果将此种损伤的微泡导入到体内的话，微泡的损伤可能在体内引发副反应。
[0011]其他人已经尝试了替代方法以分离微泡。但是，所采用的所述替代方法经常分离出微泡的子级分(sub
‑
fraction)或效率低下。例如，美国专利申请US2011003008A1公开了一种由骨髓间充质干细胞分泌的颗粒并且包含骨髓间充质干细胞的至少一种生物学性质。所述生物学性质可以包含骨髓间充质干细胞条件培养基(MSC
‑
CM)的生物活性，诸如心脏保护或缩小梗死面积。所述颗粒可以包含囊泡或外来体。
[0012]在另一个例子中，美国专利申请US20120070858A1公开了一种通过基于外来体的预先确定Zeta电位的电荷吸引机制使用氧化铁(Fe3O4)的超顺磁性纳米颗粒从血小板分离外来体的方法。该方法涉及氧化铁纳米颗粒的使用，该氧化铁纳米颗粒是预先合成的[sic(照抄原文)]、具有预先确定的正电荷并且结合到生物样品中含有的负电荷外来体。在培育的过程中，所述阳离子磁性纳米颗粒由于静电相互作用而被外来体膜的表面吸收。所述材料在磁场中的暴露使得能够分离结合至所述纳米颗粒的外来体。这种技术的成功已经通过流式细胞仪[sic]对所述外来体的表征[sic]而得到了证实。该方法由于能够分离并纯化外来体而不会改变它们的原始形态和结构特征，所以已经证明其适合于此目的。
[0013]在另一个例子中，PCT专利申请WO2012169970A1公开了连同对流层析、流化床或共沉淀的应用而在生物材料(如抗体、病毒、细胞和细胞器)的纯化中使用约束共水化剂的材料和方法。
[0014]因此，仍然需要提供一种无损伤且以充足的量分离并纯化微泡的方法，所分离的微泡随后可以用于诊断疾病、治疗或研究。
[0015]本专利技术提供了用于从生物流体分离微泡的方法，其不会损伤所述微泡的结构和/或功能的完整性。本专利技术还提供用于从生物流体分离外皮层、微粒、微泡、纳米囊泡、脱落囊泡、凋亡小体或膜颗粒的方法，其不会损伤它们的结构和/或功能的完整性。

技术实现思路

[0016]在一个实施方式中，本专利技术提供一种从细胞培养上清液或生物流体分离和/或纯化微泡的方法，其利用沉淀剂通过置换溶剂化的水而从所述细胞培养上清液或生物流体中沉淀出所述微泡。
[0017]在一个实施方式中，本专利技术提供一种分离的微泡的制剂。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以产生外皮层的制剂。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以产生微粒的制剂。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以产生纳米囊泡的制剂。在一个实施方式中，所这分离的微泡的制剂随后被纯化以产生脱落囊泡的制剂。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以产生膜颗粒的制剂。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以产生凋亡小体的制剂。
[0018]在一个实施方式中，本专利技术提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强血管生成。
在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂促进或增强患者中的血管生成。
[0019]在一个实施方式中，本专利技术提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强神经元再生。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂促进或增强患者中的神经元再生。
[0020]在一个实施方式中，本专利技术提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强细胞增殖。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂促进或增强患者中的细胞增殖。
[0021]在一个实施方式中，本专利技术提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强细胞迁移。在一个实施方式中，所述分离的微泡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用沉淀剂从生物流体分离和/或纯化微泡的方法，所述沉淀剂通过置换溶剂化的水从所述生物流体沉淀出微泡。2.一种分离的微泡的制剂，其促进或增强血管生成。3.一种分离的微泡的制剂，其促进或增强神经元再生。4.一种分离的微泡的制剂，其促进或增强细胞增殖。5.一种分离的微泡的制剂，其促进或增...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：迈阿密大学，
类型：发明
国别省市：