人T细胞的培养方法及无血清培养基组合技术

本发明专利技术涉及一种人T细胞无血清培养基及其配制方法，所述培养基的成分中含有：L-Glutamine、F-68、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷、IGF-I、亚油酸、吡哆胺二盐酸盐。本发明专利技术人T细胞无血清培养基组合培养得到的人T细胞在细胞总数、增殖速度、扩增倍数和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术，满足临床治疗所需。本发明专利技术人T细胞无血清培养基组合的三种培养基中使用相同的基础培养基，便于人T细胞无血清培养基组合的大量配制；基础培养基及各组分均不含动物血清，有效规避了由动物血清对接受细胞治疗患者带来的风险以及动物血清中不确定的成分对细胞培养的结果造成影响。本发明专利技术在基础培养基中加入了刀豆蛋白A和补体调节蛋白以及白介素因子。配合分阶段进行细胞培养的方法，大大提高了T细胞得率，增加了T细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本。从而降低了细胞培养的成本。

【技术实现步骤摘要】
L-组氨酸13-16mg/L，L-羟脯氨酸18-22mg/L，L-异亮氨酸35-50mg/L，L-亮氨酸 40-60mg/L，L-赖氨酸盐酸盐30-50mg/L，L-甲硫氨酸12-18mg/L，L-苯丙氨酸12-18mg/L， L-脯氨酸18-22mg/L，L-丝氨酸25-30mg/L，L-苏氨酸9-22mg/L，L-色氨酸2-16mg/L， L-酪氨酸20.5-25.5mg/L，L-缬氨酸18-22mg/L，神经细胞生长因子0.5-60ng/mL，L-门冬氨酸12-25mg/L，无水氯化钙28-32mg/L，氯化钾300-500mg/L，氯化钠4000-6000mg/L，葡萄糖1800-2200mg/L，还原谷胱甘肽0.7-1.2mg/L，维生素B12 0.003-0.08mg/L，L-谷氨酰胺200-400mg/L，生物素0.2-0.5mg/L，次黄嘌呤3-5mg/L，叶酸0.8-1mg/L，肌醇 32-36mg/L，烟酰胺0.8-1.4mg/L，氯化胆碱2.5-3.2mg/L，盐酸吡哆醇0.8-1.2mg/L，核黄素0.2-0.4mg/L，盐酸硫胺素0.8-1mg/L，表皮细胞生长因子0.5-50ng/mL，卵泡刺激因子 80-100ng/mL，刀豆蛋白10-30mg/L，补体调节蛋白1-10mg/L。
[0013]优选地，所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸260mg/L，L-门冬酰胺50mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L，L-谷氨酸25mg/L，甘氨酸10mg/L，L-组氨酸15mg/L，L-羟脯氨酸20mg/L，L-异亮氨酸50mg/L，L-亮氨酸50mg/L，L-赖氨酸盐酸盐40mg/L，L-甲硫氨酸15mg/L，L-苯丙氨酸15mg/L，L-脯氨酸20mg/L，L-丝氨酸 30mg/L，L-苏氨酸20mg/L，L-色氨酸5mg/L，L-酪氨酸23.19mg/L，L-缬氨酸20mg/L，神经细胞生长因子5ng/mL，L-门冬氨酸20mg/L，无水氯化钙30mg/L，氯化钾400mg/L，
[0014]氯化钠6000mg/L，葡萄糖2000mg/L，还原谷胱甘肽1mg/L，维生素B12 0.005mg/L， L-谷氨酰胺300mg/L，生物素0.2mg/L，次黄嘌呤4mg/L，叶酸1mg/L，i-肌醇35mg/L，烟酰胺1mg/L，氯化胆碱3mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，核黄素0.2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，表皮细胞生长因子5ng/mL，卵泡刺激因子60ng/mL，刀豆蛋白20mg/L，补体调节蛋白 5mg/L。
[0015]优选地，诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体10-90μg/L，白细胞介素
ꢀ-
2(IL-2)10-150μg/L，白细胞介素-12(IL-12)10-150μg/L，白细胞介素-15(IL-15)10-200μg/L，白细胞介素-18(IL-18)10-90μg/L，白细胞介素-21(IL-21)10-150μg/L。更优选地，所述诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体60μg/L，白细胞介素-2 50μg/L，白细胞介素-12 60μg/L，白细胞介素-1530μg/L，白细胞介素-1860μg/L，白细胞介素-2120μg/L。
[0016]优选地，增殖组分及含量为：白细胞介素-2 10-400μg/L，白细胞介素-15 10-400μg/L，白细胞介素-18 10-500μg/L，CD16单克隆抗体10-400μg/L。更优选地，所述增殖组分及含量为：白细胞介素-2 50μg/L，白细胞介素-15 30μg/L，白细胞介素-18 50μg/L，CD16 单克隆抗体30μg/L。
[0017]优选地，活化组分及含量为：白细胞介素-2 10-150μg/L，白细胞介素-15 10-150μg/L，INF-r10-120μg/L，TNF-α10-200μg/L，白细胞调节素(LR)10-90μg/L。
[0018]更优选地，所述活化组分及含量为：白细胞介素-2 30μg/L，白细胞介素-1 30μg/L， INF-r 30μ/L，TNF-α80μg/L，白细胞调节素80μg/L。
[0019]优选地，所述诱导培养基、增殖培养基和活化培养基用于T细胞不同培养阶段。
[0020]本专利技术的第二个目的通过以下技术方案予以实现：
[0021]一种人T细胞的培养方法，分阶段依次使用诱导培养基、增殖培养基和活化培养基进行细胞培养。优选地，所述T细胞的培养方法包括以下步骤：
[0022]S1、使用上述诱导培养基培养PBMC 3-4天；S2、更换为上述增殖培养基培养至第10
ꢀ-
12天；S3、更换为上述活化培养基培养至第14天，得到成熟的T细胞。优选地，PB MC的接种
密度为0.5
×
10
6-2
×
106cells/mL。
[0023]本专利技术的有益效果是：
[0024]本专利技术人T细胞无血清培养基组合培养得到的人T细胞在细胞总数、增殖速度、扩增倍数和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术，满足临床治疗所需。本专利技术人 T细胞无血清培养基组合的三种培养基中使用相同的基础培养基，便于人T细胞无血清培养基组合的大量配制；基础培养基及各组分均不含动物血清，有效规避了由动物血清对接受细胞治疗患者带来的风险以及动物血清中不确定的成分对细胞培养的结果造成影响。本专利技术在基础培养基中加入了刀豆蛋白A(和补体调节蛋白以及白介素因予。配合分阶段进行细胞培养的方法，大大提高了T细胞得率，增加了T细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本。
具体实施方式
[0025]为了更好的说明本专利技术，下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术中所用的试剂均为市售试剂，所用的培养基的配制方法、检测方法、培养方法等均为本领域人员所熟知。
[0026]实施例1、T细胞无血清培养基
[0027]为了更清楚的说明本实施例人T细胞无血清培养基组合的组分，下面结合实施例进一步阐述本专利技术。基础培养基的组分及其含量如下所述，分别按照下述含量将诱导组分、增殖组分和活化组分添加到基础培养基中，即可得到诱导培养基、增殖培养基和活化培养基。
[0028]基础培养基的组分及其含量为：
[0029][0030][0031][0032]实施例1中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量为：
[0033]诱导组分
[0034][0035]增值组分
[0036][0037]活化组分
[0038][0039][0040]实施例2、T细胞无血清培养基
[0041]基础培养基组分及含量
[0042][0043][0044][0045]实施例2中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量
[0046]诱导组分
[0047][0048]增值组分
[0049][0050][0051]活化组分
[0052][0053]实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人T细胞无血清培养基组合，包括基础培养基、增殖培养基和活化培养基，所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分，所述增殖培养基包括基础培养基和增殖组分，所述活化培养基包括基础培养基和活化组分。所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸220-320mg/L，L-门冬酰胺30-60mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐50.15-80.15mg/L，L-谷氨酸15-35mg/L，甘氨酸8-12mg/L，L-组氨酸13-16mg/L，L-羟脯氨酸18-22mg/L，L-异亮氨酸35-50mg/L，L-亮氨酸40-60mg/L，L-赖氨酸盐酸盐30-50mg/L，L-甲硫氨酸12-18mg/L，L-苯丙氨酸12-18mg/L，L-脯氨酸18-22mg/L，L-丝氨酸25-30mg/L，L-苏氨酸9-22mg/L，L-色氨酸2-16mg/L，L-酪氨酸20.5-25.5mg/L，L-缬氨酸18-22mg/L，神经细胞生长因子0.5-60ng/mL，L-门冬氨酸12-25mg/L，无水氯化钙28-32mg/L，氯化钾300-500mg/L，氯化钠4000-6000mg/L，葡萄糖1800-2200mg/L，还原谷胱甘肽0.7-1.2mg/L，维生素B12 0.003-0.08mg/L，L-谷氨酰胺200-400mg/L，生物素0.2-0.5mg/L，次黄嘌呤3-5mg/L，叶酸0.8-1mg/L，肌醇32-36mg/L，烟酰胺0.8-1.4mg/L，氯化胆碱2.5-3.2mg/L，盐酸吡哆醇0.8-1.2mg/L，核黄素0.2-0.4mg/L，盐酸硫胺素0.8-1mg/L，表皮细胞生长因子0.5-50ng/mL，卵泡刺激因子80-100ng/mL，刀豆蛋白10-30mg/L，补体调节蛋白1-10mg/L。2.根据权利要求1所述的人T细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸260mg/L，L-门冬酰胺50mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L，L-谷氨酸25mg/L，甘氨酸10mg/L，L-组氨酸15mg/L，L-羟脯氨酸20mg/L，L-异亮氨酸50mg/L，L-亮氨酸50mg/L，L-赖氨酸盐酸盐40mg/L，L-甲硫氨酸15mg/L，L-苯丙氨酸15mg/L，L-脯氨酸20mg/L，L-丝氨酸30mg/L，L-苏氨酸20mg/L，L-色氨酸5mg/L，L-酪氨酸23.19mg/L，L-缬氨酸20mg/L，神经细胞生长因子5ng/mL，L-门冬氨酸20mg/L，无水氯化钙30mg/L，氯化钾400mg/L，氯化钠6000mg/L，葡萄糖2000mg/L，还原谷胱甘肽1mg/L，维生素B12 0.005mg/L，L-谷氨酰胺300mg/L，生物素0.2mg/L，次黄嘌呤4mg/L，叶酸1mg/L，i-肌醇35mg/L，烟酰胺1mg/L，氯化胆碱3mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，核黄素0.2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，表皮细胞生长因子5ng/mL，卵泡刺激因子60ng...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书一八页，
申请(专利权)人：苏州易迈吉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：