一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用。具体提供了一种种子特异性干扰载体，所述载体为pOsOle18‑RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 9所示。利用所述pOsOle18‑RNAi载体，可以特异性地干扰靶基因在水稻种子中的表达，而不影响靶基因在其他组织器官中的正常表达，从而不仅可以有效研究靶基因对种子发育的直接调控作用，还能达到改良水稻粒型、产量和稻米品质的目的，为水稻产量和稻米品质的分子精准设计育种提供了一种行之有效的技术手段和解决方案。同时还提供了一种基于pOsOle18‑RNAi载体的OsMADS1种子特异性干扰载体pOsOle18::OsMADS1‑RNAi，其DNA序列如SEQ ID NO 10所示；利用该载体可提高稻米中的蛋白质含量，增加稻米的营养价值。本发明专利技术具有重要的科研意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用。
技术介绍
稻米是全球超过半数人口的主要口粮，也是人类淀粉和蛋白质的基本来源。水稻种子的生长发育不仅控制水稻产量构成三要素之一的千粒重，同时也是直接决定水稻蛋白质含量等稻米营养品质的重要因素。水稻种子的形态发育和稻米蛋白质含量受一系列的重要基因调控。因此，研究这些重要调控基因的功能及其对种子形态发育和稻米蛋白质含量的调控机理，是利用这些重要基因开展种子精准设计育种与基因工程育种，选育高产优质水稻新品种的基础。目前，植物组成型RNA干扰(RNAi)技术是研究和利用这些重要基因功能的一种重要的有效手段。这种技术使用在特定植物各个组织器官恒定高表达的组成型启动子，驱动包含靶基因一段正义和反义DNA片段的短发夹RNA(ShorthairpinRNA,shRNA)的表达，进而引发由Dicer核糖核酸内切酶介导的特异性降解靶基因的mRNA，使靶基因在植株各发育阶段、各组织器官的表达沉默或表达量下降，从而通过RNAi植株的表型来研究靶基因的整体功能，和对植物各时期、各个组织器官的发育调控作用。但是，植物组成型RNA干扰技术在研究和利用水稻种子发育重要调控基因方面也存在明显的缺陷和不足。因为部分基因除了调控水稻种子发育外，还对育性或/和株型等其他农艺性状有重要的调控作用。如果利用组成型RNA干扰技术抑制这类基因在种子中的表达，就同时也会影响靶基因在花或/和根茎叶等其他器官中的正常表达和调控功能，影响育性或/和株型，会对特意研究靶基因对种子发育的调控功能及其后续利用造成不必要的干扰。类似地，现在常用的CRISPR/Cas9等植物基因编辑系统会对受体靶基因的DNA形成碱基插入和缺失等不可逆转的突变，并将突变稳定遗传给受体后代，影响受体所有器官、组织和细胞中靶基因的正常功能。所以，使用CRISPR/Cas9等植物基因编辑系统也会对特意研究靶基因对种子发育的调控功能及其后续利用造成不必要的干扰。因此，植物组成型RNA干扰技术和CRISPR/Cas9等植物基因编辑系统在上述
都存在明显的技术局限和不足。OsMADS1基因是水稻MADS-Box转录调控因子基因家族中的重要成员，其主要在种子和花中表达。OsMADS1除调控水稻花分生组织的分化、花原基的形成和控制花正常发育外，还通过与OsDEP1、OsGS3等基因互作调控种子粒型，影响稻米外观品质。OsMADS1组成型RNA干扰植株出现花器官变异、结实率极显著下降、谷粒粒长极显著增加且颖壳不闭合的异常表型。利用组成型RNA干扰技术组成型干扰OsMADS1基因的表达，不能特意研究OsMADS1对种子发育和稻米品质的独特调控功能。另一方面，蛋白质是稻米中的第二大类营养成分。同时，蛋白质含量也是决定稻米营养价值与品质性状的重要指标。培育蛋白质含量适中的优良水稻品种一直是育种家的一项重要的育种目标。但水稻籽粒中的蛋白质含量在禾谷类作物中最低，糙米的蛋白质含量一般占干重的8％～10％。另外，稻米的蛋白质含量受复杂数量性状位点和环境因素的综合调控，使得通过常规育种方法培育蛋白质含量适中的优良水稻品种难度大、周期长。因此，使用基因工程技术定向提高稻米的蛋白质含量不失为一种有效的策略。现有的尝试中，有些虽能提高稻米的蛋白质含量，但也伴随带来了植株育性和产量极显著降低等不利性状。例如，Liao等2018使用组成型RNA干扰技术抑制OsDCL3b基因，使干扰植株的蛋白含量由9.01％提高至10.40％。但是，同时干扰植株的育性和产量极显著下降，难以进行实际应用(LiaoPF,OuyangJX,ZhangJJ,etal.OsDCL3baffectsgrainyieldandqualityinrice[J].PlantMolecularBiology,2019,99(3):193-204.)。同时，虽然OsMADS1基因对水稻花发育具有重要调控功能，但是其对水稻种子发育和稻米品质发育的直接调控作用还并不清楚，同时也未见利用OsMADS1基因在提高稻米蛋白质含量应用方面的研究报道与专利技术专利。综上，如果能提供一种种子特异性干扰载体，特异性地干扰水稻种子发育和稻米蛋白质等营养品质调控基因(如OsMADS1等)的表达，则不仅能特意研究OsMADS1等这些基因对水稻种子发育和稻米蛋白质等营养品质的独特调控功能，还能够应用这种种子特异性干扰载体特异性地调控OsMADS1等这些基因的表达，从而达到提高水稻产量、改良稻米蛋白质含量等品质性状的目的，将具有十分重要的科研价值和现实应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种种子特异性干扰载体及其应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种种子特异性干扰载体，所述载体为pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQIDNO9所示。相应的，所述种子特异性干扰载体的制备方法，包括如下步骤：(1)获得双酶切pLHRNAi线性载体；(2)将所述线性载体与pOsOle18的DNA片段进行同源重组反应，即得所需的种子特异性干扰载体。优选的，步骤(1)所述双酶切为使用HindIII和KpnI限制性内切酶进行。相应的，所述pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体在研究种子表达基因的功能中的应用。相应的，所述pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体在种子中特异性调控种子发育和/或蛋白质含量调节基因的表达，调控种子发育、改良水稻粒型、调控稻米蛋白质含量中的应用。相应的，一种OsMADS1种子特异性干扰载体，所述载体为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体，其DNA序列如SEQIDNO10所示。相应的，所述OsMADS1种子特异性干扰载体的制备方法，包括如下步骤：(1)获得pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQIDNO9所示；(2)获得OsMADS1基因正义干扰片段，其DNA序列如SEQIDNO3所示；(3)获得OsMADS1基因反义干扰片段，其DNA序列如SEQIDNO4所示；(4)将所述OsMADS1基因正义干扰片段和OsMADS1基因反义干扰片段分别插入所述pOsOle18-RNAi载体中，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体；具体按方法1或方法2进行：方法1：将所述OsMADS1基因正义干扰片段插入所述pOsOle18-RNAi载体，得到含有所述OsMADS1基因正义干扰片段插入的中间载体A，再将所述OsMADS1基因反义干扰片段插入所述中间载体A，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体；方法2：将所述OsMADS1基因反义干扰片段插入所述pOsOle18-RNAi载体，得到含有所述OsMADS1基因反义干扰片段插入的中间载体B，再将所述OsMADS1基因正义干扰片段插入所述中间载体B，即得所需的pOs本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种种子特异性干扰载体，其特征在于：所述载体为pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 9所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种种子特异性干扰载体，其特征在于：所述载体为pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQIDNO9所示。


2.权利要求1所述种子特异性干扰载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)获得双酶切pLHRNAi线性载体；
(2)将所述线性载体与pOsOle18的DNA片段进行同源重组反应，即得所需的种子特异性干扰载体。


3.根据权利要求2所述的种子特异性干扰载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述双酶切为使用HindIII和KpnI限制性内切酶进行。


4.权利要求1所述种子特异性干扰载体在研究种子表达基因的功能中的应用。


5.权利要求1所述种子特异性干扰载体在种子中特异性调控种子发育和/或蛋白质含量调节基因的表达，调控种子发育、改良水稻粒型、调控稻米蛋白质含量中的应用。


6.一种OsMADS1种子特异性干扰载体，其特征在于：所述载体为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体，其DNA序列如SEQIDNO10所示。


7.权利要求6所述OsMADS1种子特异性干扰载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)获得pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQIDNO9所示；
(2)获得OsMADS1基因正义干扰片段，其DNA序列如SEQIDNO3所示；
(3)获得OsMADS1基因反义干扰片段，其DNA序列如SEQIDNO4所示；
(4)将所述OsMADS1基因正义干扰片段和OsMADS1基因反义干扰片段分别插入所述pOsOle18-RNAi载体中，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体；具体按方法1或方法2进行：
方法1：将所述OsMADS1基因正义干扰片段插入所述pO...

【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，李鹏慧，涂升斌，黄维藻，汪松虎，蒋海波，刘阳轩，古袁扬，庄勇，刘志坚，魏明，唐钰莹，乐露，路龙祥，胡永志，喻兰，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51