α-亚麻酸在制备抗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了α‑亚麻酸在制备抗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用，本发明专利技术公开了ALA的处理降低了铜绿假单胞菌III型分泌系统相关蛋白的表达，而III型分泌系统是影响细菌病原体致病性的关键毒力因子，ALA可提高感染铜绿假单胞菌的小鼠模型中宿主细胞的存活率。这是首次关于ALA对铜绿假单胞菌具有抗感染活性能力的报道研究，为控制这种致命病原体提供了新的方法和理论依据。

【技术实现步骤摘要】
α-亚麻酸在制备抗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用
本专利技术涉及微生物防治
，具体地，涉及α-亚麻酸在制备抗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。
技术介绍
铜绿假单胞菌是条件型致病的革兰氏阴性菌，该病菌的传播已成为全球关注的问题。铜绿假单胞菌的感染对于免疫功能低下的宿主是致命的，如癌症和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)患者。铜绿假单胞菌是对多种抗生素具有抗性的人体致病菌，是医院外科手术患者死亡的主要原因。该病菌的致病机理是多因素且复杂的，主要包括鞭毛、菌毛、群体感应(QS)和蛋白质分泌系统，例如T3SS(III型分泌系统)和T6SS(VI型分泌系统)。T3SS是关键毒力因子分泌系统，其具有特殊的针状结构，在多种病原菌中均发现，可直接将病原菌的毒力因子分泌至宿主细胞中。在宿主细胞中，细菌毒力因子诱导细胞凋亡和/或坏死，抑制免疫反应，并抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞的聚集及其吞噬活性。据报道，有40多种蛋白质参与组成T3SS特定结构，这些蛋白质的表达主要受ExsA蛋白调节。ExsA通过直接结合这些基因的启动子来调控T3SS基因。ExsA由exsCEBA操纵子编码，该操纵子由一系列蛋白质调节，包括ExsC，ExsD，ExsE，Vfr，RtsM，RetS和GacA。另外，QS调节T3SS的表达，表明铜绿假单胞菌进化出的毒力系统非常复杂。近年来，在世界范围内已经报道了对多种抗生素如头孢霉素和碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌中存在多种机制增强了其对抗生素的耐药性，使患者的治疗受到限制，提高了发病率和死亡率。>α-亚麻酸(ALA)是一种短链的omega-3脂肪酸，由于其对人类心血管系统和人类健康的有益作用而被广泛研究，但其作为抗菌物质的应用仍有待研究。omega-6和omega-3多不饱和脂肪酸是人体中具有各种功能的必需元素，其与磷脂，细胞膜，前列腺素的合成相关。有研究表明含氧不饱和脂肪酸已被鉴定为一种新型的自诱导信号，可调节铜绿假单胞菌中基因的表达，例如Omega-6脂肪酸已被证明对肺炎球菌具有很强的抑菌活性，包括ALA及其衍生物EPA和DHA在内的omega-3脂肪酸可维持心血管系统功能，有助于人体细胞生长。其中，ALA作为抗菌物质的作用仍有待进一步研究，该类化合物可通过影响某些微生物的生长从而影响人体健康。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供α-亚麻酸在制备抗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：本专利技术公开了ALA可以通过抑制铜绿假单胞菌III型分泌系统T3SS基因的表达，降低铜绿假单胞菌对肺癌细胞A549的细胞毒性。进一步体内实验表明，ALA治疗可减轻肺部损伤，并提高铜绿假单胞菌感染小鼠模型的动物存活率。因此本专利技术要求保护α-亚麻酸在制备抗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。本专利技术还要求保护α-亚麻酸在制备抑制铜绿假单胞菌生长的药物中的应用。优选地，α-亚麻酸抑制铜绿假单胞菌III型分泌系统的表达。优选地，α-亚麻酸提供感染宿主的存活率。更优选地，抑制宿主的中性粒细胞聚集。更优选地，保持宿主正常的肺泡结构。本专利技术还要求保护α-亚麻酸在制备抑制铜绿假单胞菌III型分泌系统的表达的药物中的应用。本专利技术还要求保护一种抗铜绿假单胞菌感染和/或抑制铜绿假单胞菌生长的药物，含有α-亚麻酸。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了ALA的处理降低了铜绿假单胞菌III型分泌系统相关蛋白的表达，而III型分泌系统是影响细菌病原体致病性的关键毒力因子，ALA可提高感染铜绿假单胞菌的小鼠模型中宿主细胞的存活率。这是首次关于ALA对铜绿假单胞菌具有抗感染活性能力的报道研究，为控制这种致命病原体提供了新的方法和理论依据。附图说明图1为ALA对铜绿假单胞菌PAO1或PA14感染的A549细胞活力的影响。图2为ALA处理对铜绿假单胞菌PAO1T3SS的影响。图3为ALA通过作用于细菌T3SS影响铜绿假单胞菌的毒力。图4为ALA处理对铜绿假单胞菌PAO1或PA14感染的小鼠存活的影响。图5为ALA处理可保护由铜绿假单胞菌感染引起的小鼠肺部损伤。具体实施方式下面结合说明书附图及具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。细菌菌株和培养条件：细菌菌株铜绿假单胞菌PAO1，PA14，ΔexsAPAO1为本实验室提供；T3SS的表达是通过在LB培养基中添加最终浓度为7.5mM的次氮基苯甲酸(NTA)来诱导的；A549在DMEM培养基中培养，该培养基中添加了10％的胎牛血清。试验材料：BALB/c小鼠无限制地使用食物和水，在无病原体条件下饲养。用于本专利技术的所有小鼠均为5～6周龄、体重22～25克。所有动物方案都经中国广州华南农业大学动物实验中心的同意和批准。ALA从Sigma-Aldrich购买。在实验室中制备了针对SpuE，ExsA，Exos和PcrV的抗体。实施例1ALA对铜绿假单胞菌感染A549细胞的保护作用1、实验方法将A549细胞接种到含有100μLDMEM培养基的96孔板中，在37℃下培养16～18h，以获得80～90％的单层细胞。现有技术中据报道了铜绿假单胞菌PAO1和PA14对A549细胞的细胞毒性。(Immunologicalblockingofspermidine-mediatedhost–pathogencommunicationprovideseffectivecontrolagainstPseudomonasaeruginosainfection)，为了确定ALA是否抑制铜绿假单胞菌的感染，将A549细胞用浓度不同(0、10和30μM)的ALA预处理2小时，加入铜绿假单胞菌PAO1或PA14菌株侵染细胞，以未经ALA预处理的细胞作为对照。2、实验结果当被铜绿假单胞菌PAO1或PA14感染预处理的A549细胞时，的细胞活力以ALA剂量依赖性的方式增强(图1)。相反，未经ALA预处理但感染了PAO1或PA14的A549细胞的存活率低于5％，而没有感染铜绿假单胞菌PAO1和PA14的A549细胞则没有细胞死亡(图1)。这表明经过ALA预处理后，提高了A549细胞在铜绿假单胞菌侵染中的存活率。实施例2外源添加ALA抑制T3SS的转录和翻译表达1、实验方法(1)实时荧光定量PCR分析为了确定ALA对基因表达的影响，通过实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌PAO1的T3SS相关基因表达情况。铜绿假单胞菌PAO1在液体LB培养基中生长直至OD600达到1.5，使用RNeasymini试剂盒(Qiagen)提取总RNA，通过紫外分光光度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.α-亚麻酸在制备抗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.α-亚麻酸在制备抗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。


2.α-亚麻酸在制备抑制铜绿假单胞菌生长的药物中的应用。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，α-亚麻酸抑制铜绿假单胞菌III型分泌系统的表达。


4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，α-亚麻酸提供感染宿主的存活率。

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【专利技术属性】
技术研发人员：张炼辉，王建和，吴晓妍，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44