体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法技术

本发明专利技术公开了一种体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6‑羟基氯唑沙宗的定量测试方法，包括如下步骤：采用甲醇稀释混合储备液得到标准曲线工作液，任意一个浓度的标准曲线工作液中氯唑沙宗和6‑羟基氯唑沙宗的浓度相同。采用体外孵育体系对标准曲线工作液进行稀释，得到标准曲线样品。将标准曲线样品采用LC‑MS/MS进样分析，得到线性回归方程。将氯唑沙宗在体外孵育体系中进行孵育得到孵育物，将孵育物采用LC‑MS/MS进样分析，根据氯唑沙宗线性回归方程和6‑羟基氯唑沙宗线性回归方程，计算孵育物中氯唑沙宗及其特异性产物6‑羟基氯唑沙宗的浓度。本发明专利技术定量测试方法缩短了分析时间，提高了检测效率，确保试验结果的准确性，并且符合方法学验证要求。

【技术实现步骤摘要】
体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法
本专利技术涉及一种体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法。
技术介绍
氯唑沙宗是一种口服中枢性肌肉松弛剂，作用快而持久，可有效缓解各种急慢性扭伤、挫伤、肌肉劳损等引起的软组织疼痛以及中枢神经引起的肌肉痉挛疼痛。它在肝脏内主要代谢为6-羟基氯唑沙宗，这一过程为CYP2E1特异性催化。肝脏是药物代谢及生物转化的重要场所，而由于个体、种族、性别的不同，肝脏中CYP酶的活性存在较大差异。因此，有效评价氯唑沙宗在肝微粒体中的代谢性能，能够为临床用药提供实验依据。氯唑沙宗在肝微粒体中的代谢性能的评价，一般是在肝微粒体孵育体系中对氯唑沙宗进行孵育，孵育完成后测试氯唑沙宗原型成分的减少量，以判断代谢结果。因此，有必要开发一种体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法。
技术实现思路
为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法，其缩短了分析时间，提高了检测效率，确保试验结果的准确性，并且符合方法学验证要求。本专利技术公开了一种体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法，包括如下步骤：配置混合储备液，使所述混合储备液中氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗的浓度相同；采用甲醇稀释混合储备液得到氯唑沙宗系列浓度为1～1000ng/mL的标准曲线工作液，任意一个浓度的标准曲线工作液中氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗的浓度相同；采用体外孵育体系对所述标准曲线工作液进行稀释，得到氯唑沙宗系列浓度为0.1～100ng/mL的标准曲线样品；向每个标准曲线样品中加入含甲苯磺丁脲的甲醇沉淀剂，振荡、离心后，取上清采用LC-MS/MS进样分析，得到氯唑沙宗线性回归方程和6-羟基氯唑沙宗线性回归方程；将氯唑沙宗在体外孵育体系中进行孵育得到孵育物，向孵育物中加入含甲苯磺丁脲的甲醇沉淀剂，经振荡、离心后，取上清采用LC-MS/MS进样分析，根据氯唑沙宗线性回归方程和6-羟基氯唑沙宗线性回归方程，计算孵育物中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的浓度；其中，色谱条件如下：柱温40℃；自动进样器温度4℃；进样体积5μL；保留时间：氯唑沙宗1.0min，6-羟基氯唑沙宗0.9min，甲苯磺丁脲1.0min；流动相A为含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱方式，流速为0.5mL/min，洗脱时长为1.5min，洗脱程序为：0.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；0.5min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；1.0min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；1.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；1.5min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％。作为优选，LC-MS/MS检测中质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；离子化模式：负离子模式；扫描方式：多反应检测扫描；碰撞气：9psi；气帘气：30psi；ResolutionQ1/Q3：Unit/Unit；喷雾电压：-4500v；离子化温度：500℃；保留时间：1.5min。进一步优选，所述氯唑沙宗的质谱条件为：Q1：168.1Da；Q3：132.1Da；时间：100ms；去簇电压：-70v；碰撞电压：-30v；碰撞室射出电压：15v；射入电压：10v。进一步优选，所述6-羟基氯唑沙宗的质谱条件为：Q1：184.1Da；Q3：132.1Da；时间：100ms；去簇电压：-60v；碰撞电压：-25v；碰撞室射出电压：15v；射入电压：10v。进一步优选，所述甲苯磺丁脲的质谱条件为：Q1：269.1Da；Q3：170.0Da；时间：100ms；去簇电压：-30v；碰撞电压：-30v；碰撞室射出电压：15v；射入电压：10v。作为优选，所述混合储备液中氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗的浓度均为0.5mg/mL。作为优选，所述标准曲线工作液中氯唑沙宗系列浓度为1、2、5、10、30、100、300、1000ng/mL。作为优选，所述步骤“采用体外孵育体系对所述标准曲线工作液进行稀释，得到氯唑沙宗系列浓度为0.1～100ng/mL的标准曲线样品”中，将标准曲线工作液和体外孵育体系按照体积比1:9混合，得到氯唑沙宗系列浓度为0.1、0.2、0.5、1、3、10、30、100ng/mL的标准曲线样品。作为优选，所述甲醇沉淀剂中甲苯磺丁脲的浓度为50ng/mL。作为优选，其特征在于，所述体外孵育体系包括人肝微粒体、NADPH、氯化镁和PBS缓冲液。本专利技术的有益效果如下：本专利技术体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法同时检测氯唑沙宗原型与代谢产物，针对一些需要同时检测分析的试验，缩短了分析时间，提高了检测效率。针对一些不必需同时检测分析的试验，相当于增加了联合检测，确保试验结果的准确性。本专利技术体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法进行了系统的方法学验证，确保检测结果的准确性。本专利技术体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法基质效应小、批内和批间准确度与精密度高、稳定性高，符合方法学验证要求，具有广泛的应用前景。为让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例作详细说明如下。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本实施例提供可一种体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法，本实施例中空白基质为包含人肝微粒体、NADPH、氯化镁和PBS缓冲液的肝微粒体孵育体系。甲醇沉淀剂中甲苯磺丁脲的浓度为50ng/mL，甲苯磺丁脲即为本实施例的内标物。本实施例外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法包括如下步骤：步骤一、建立氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗线性回归方程：(1)配置标准曲线样品采用甲醇和氯唑沙宗标准品配置氯唑沙宗浓度为1mg/mL的氯唑沙宗储备液；采用甲醇和6-羟基氯唑沙宗标准品配置6-羟基氯唑沙宗浓度为1mg/mL的6-羟基氯唑沙宗储备液；将氯唑沙宗储备液和6-羟基氯唑沙宗储备液按照体积比1:1混合，得到氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗的浓度均为0.5mg/mL的混合储备液。采用甲醇稀释混合储备液，得到氯唑沙宗浓度为1、2、5、10、30、100、300、1000ng/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法，其特征在于，包括如下步骤：/n配置混合储备液，使所述混合储备液中氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗的浓度相同；/n采用甲醇稀释混合储备液得到氯唑沙宗系列浓度为1～1000ng/mL的标准曲线工作液，任意一个浓度的标准曲线工作液中氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗的浓度相同；/n采用体外孵育体系对所述标准曲线工作液进行稀释，得到氯唑沙宗系列浓度为0.1～100ng/mL的标准曲线样品；/n向每个标准曲线样品中加入含甲苯磺丁脲的甲醇沉淀剂，振荡、离心后，取上清采用LC-MS/MS进样分析，得到氯唑沙宗线性回归方程和6-羟基氯唑沙宗线性回归方程；/n将氯唑沙宗在体外孵育体系中进行孵育得到孵育物，向孵育物中加入含甲苯磺丁脲的甲醇沉淀剂，经振荡、离心后，取上清采用LC-MS/MS进样分析，根据氯唑沙宗线性回归方程和6-羟基氯唑沙宗线性回归方程，计算孵育物中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的浓度；/n其中，色谱条件如下：柱温40℃；自动进样器温度4℃；进样体积5μL；保留时间：氯唑沙宗1.0min，6-羟基氯唑沙宗0.9min，甲苯磺丁脲1.0min；流动相A为含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱方式，流速为0.5mL/min，洗脱时长为1.5min，洗脱程序为：/n0.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；/n0.5min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；/n1.0min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；/n1.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；/n1.5min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％。/n...

【技术特征摘要】
1.一种体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法，其特征在于，包括如下步骤：
配置混合储备液，使所述混合储备液中氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗的浓度相同；
采用甲醇稀释混合储备液得到氯唑沙宗系列浓度为1～1000ng/mL的标准曲线工作液，任意一个浓度的标准曲线工作液中氯唑沙宗和6-羟基氯唑沙宗的浓度相同；
采用体外孵育体系对所述标准曲线工作液进行稀释，得到氯唑沙宗系列浓度为0.1～100ng/mL的标准曲线样品；
向每个标准曲线样品中加入含甲苯磺丁脲的甲醇沉淀剂，振荡、离心后，取上清采用LC-MS/MS进样分析，得到氯唑沙宗线性回归方程和6-羟基氯唑沙宗线性回归方程；
将氯唑沙宗在体外孵育体系中进行孵育得到孵育物，向孵育物中加入含甲苯磺丁脲的甲醇沉淀剂，经振荡、离心后，取上清采用LC-MS/MS进样分析，根据氯唑沙宗线性回归方程和6-羟基氯唑沙宗线性回归方程，计算孵育物中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的浓度；
其中，色谱条件如下：柱温40℃；自动进样器温度4℃；进样体积5μL；保留时间：氯唑沙宗1.0min，6-羟基氯唑沙宗0.9min，甲苯磺丁脲1.0min；流动相A为含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱方式，流速为0.5mL/min，洗脱时长为1.5min，洗脱程序为：
0.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；
0.5min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；
1.0min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；
1.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；
1.5min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％。


2.根据权利要求1所述的体外孵育中氯唑沙宗及其特异性产物6-羟基氯唑沙宗的定量测试方法，其特征在于，LC-MS/MS检测中质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；离子化模式：负离子模式；扫描方式：多反应检测扫描；碰撞气：9psi；气帘气：30psi；ResolutionQ1/Q3：Unit/Unit；喷雾电压：-4500v；离子化温度：500℃；保留时间：1.5min。


3.根据权利要求2所述的体外...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，盘建红，
申请(专利权)人：安领生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32