同时检测牛轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒及应用方法技术

本发明专利技术提供了一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒及应用，属于病毒检测技术领域，包括针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的三组特异性引物和三个相应的探针。本发明专利技术用于检测三种病毒的引物和探针具有特异性强、反应效率高的优点；该三重实时荧光定量PCR试剂盒具有扩增效率高、特异性强、检测效果稳定，重复性好的特点，适用于奶牛腹泻致病原检测、定期监测，以及奶牛腹泻流行病学调查等；应用本发明专利技术的试剂盒在一个实时荧光定量PCR反应体系中能够同时检测三种奶牛腹泻致病原，节约了检测时间、降低了检测成本，且能同时检测多个样本，检测效率高。

【技术实现步骤摘要】
同时检测牛轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒及应用方法
本专利技术涉及一种牛腹泻病原体检测试剂盒，尤其涉及一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，属于病毒检测

技术介绍
牛轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒是引起牛病毒性腹泻的重要病原。随着我国奶牛养殖业规模化，集约化高度发展，牛腹泻，尤其是新生犊牛腹泻成为困扰奶牛养殖业的重要疾病之一，严重危害牛群健康并阻碍我国奶牛养殖业的发展。牛轮状病毒((BovineRotavirus,BRV)病是由轮状病毒引起的多种幼龄动物和婴幼儿的急性胃肠道传染病，以精神委顿、厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征。本病病原为轮状病毒，病毒粒子呈圆形，似车轮状。病毒对外界因素的抵抗力较强，在粪便和不含抗体的乳汁中，经半年仍有感染性。患者及隐性感染者的粪便内含有大量的轮状病毒，并可经消化道传染给易感人畜。在人和各种动物间有一定交互感染作用，只要病毒在人或一种动物中持续存在，就有可能造成本病在自然界中长期传播。本病主要发生在犊牛，发病日龄主要为15～90天。春、秋两季发病较多。病毒存在于肠道，随粪便排出体外，经消化道感染。牛冠状病毒(Bovinecoronavirus，BCV)是引起新生犊牛腹泻的一种重要的病原，还可引起牛的呼吸道感染和成年牛的冬季血痢。自从1973年美国Mebus等人首次报道该病原以来，随后证明BCV在世界范围内广泛分布，在许多国家和地区牛群中流行。1987年，国内有学者报道在我国牛群中也流行该病。BCV引起的犊牛腹泻仅次于轮状病毒，并且可导致人的腹泻。牛病毒性腹泻性病毒((BovineViralDiarrheaVirus，BVDV)，属于黄病毒科瘟病毒属，病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或间接接触方式传播。牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛腹泻性病毒是引起犊牛腹泻的重要病原，三种病毒引起的腹泻临床症状相似、发病急、易混合感染；实际生产中牧场因为病原不确定，无鉴别诊断或诊断不及时等因素，对犊牛腹泻不能采取对症治疗，致使犊牛腹泻发病率达70％，死亡率高达50％，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。解决我国牧场犊牛腹泻防控困境的关键是快速有效的对症治疗和针对性预防措施的有效结合，因此建立针对牛轮状病毒、冠状病毒和牛腹泻性病毒的实验室快速鉴别诊断方法，特别是快速确定传染性病原方法，为牛场进行快速准确的对症治疗和精准采取预防性措施是当前紧迫需求。目前，分别检测牛轮状病毒、冠状病毒和牛腹泻性病毒的技术一般来说有三类，血清学诊断技术、生物学试验和分子生物学诊断技术。包括病毒分离、中和试验、电镜观察、ELISA、RT-PCR、免疫荧光、荧光定量PCR等。血清学诊断技术包括补体结合试验、中和试验、免疫扩散、免疫电泳技术、免疫荧光、免疫电镜技术和ELISA。在这些技术中,ELISA方法用于高通量实验室检测，但是检测灵敏性低于荧光定量PCR，而且只能定性不能定量。其他检测方法，由于试验时间长、材料多、检测具有明显滞后性而且重复性差，多用于科研很少用于实际生产中检测。生物学试验包括病毒细胞培养和动物试验。这种检测方法敏感性低、成本高、周期长，主要用于科研特殊需要，基本不用于生产中病原检测。分子生物学诊断技术包括核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳、RT-PCR、nano-PCR、荧光定量PCR等。其中核酸杂交和聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测技术操作复杂、成本高，不适用于临床检测。RT-PCR、nano-PCR、荧光定量PCR等检测技术特异性好、检测灵敏度好，可以针对组织、血液、粪便等样本进行检测；但是由于RT-PCR和nano-PCR不适用批量检测，在生产中应用还受限制；同时RT-PCR方法检测后需要电泳检测，检测灵敏度低，在快速检测中逐步被实时荧光定量PCR取代。荧光定量PCR方法是一种快速、准确、高通量病毒检测技术，近年来广泛应用于丙肝、艾滋病等病原的快速诊断；但是现有的针对牛轮状病毒、冠状病毒、或者牛病毒性腹泻病毒的检测方法都是单重荧光定量PCR检测，在实际生产应用中单重荧光定量PCR检测技术不能满足临床快速、准确、高通量对引起犊牛腹泻的多种病毒性病原鉴别诊断的需求。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种能同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒以及利用该试剂盒检测上述三种病毒的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案内容为：一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，包括针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的三组特异性引物和三个相应的探针。进一步的，所述针对牛轮状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQIDNO:1所示、下游核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，对应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述针对牛冠状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQIDNO:4所示、下游核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，对应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；所述针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQIDNO:7所示、下游核苷酸序列如SEQIDNO:8所示，对应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。进一步的，所述三个探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。进一步的，所述荧光报告基团选自NED、FAM和JOE，所述荧光淬灭基团为BHQ1。进一步的，所述试剂盒的反应体系包括荧光定量PCR反应液、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、标准阳性RNA模板。进一步的，所述标准阳性RNA模板是采用T7体外转录试剂盒制备得到的牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒的标准RNA。进一步的，所述反应体系所需各物质的量为：12.5μL的荧光定量PCR反应液，1μL的逆转录酶，1.5μL的TaqDNA聚合酶，牛轮状病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，牛冠状病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，牛病毒性腹泻病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，阴性对照1μL，标准阳性RNA模板1μL。一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒的应用方法，所述试剂盒用于奶牛腹泻致病原检测，牛场腹泻病原定期监测，以及奶牛腹泻流行病学调查；所述奶牛腹泻致病原为牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒这三种。进一步的，包括如下检测步骤：S1选取待测样品，提取RNA备用；所述待测样品为牛的粪便或血液；S2取试剂盒，按照每个PCR扩增体系中加入1μL步骤S1得到的样品RNA进行扩增反应；PCR扩增反应条件为42℃30min，95℃预变性1min；95℃15s，53℃40s，40个循环；S3记录检测结果，根据检测结果判断牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的有无及含量。进一步的，所述试剂盒RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的三组特异性引物和三个相应的探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的三组特异性引物和三个相应的探针。


2.根据权利要求1所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述针对牛轮状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQIDNO:1所示、下游核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，对应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述针对牛冠状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQIDNO:4所示、下游核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，对应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；所述针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQIDNO:7所示、下游核苷酸序列如SEQIDNO:8所示，对应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。


3.根据权利要求1所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述三个探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。


4.根据权利要求3所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团选自NED、FAM和JOE，所述荧光淬灭基团为BHQ1。


5.根据权利要求1所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系包括荧光定量PCR反应液、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、标准阳性RNA模板。


6.根据权利要求5所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述标准阳性RNA模板是采用T7...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华林，张丹，刘邓，
申请(专利权)人：北京三元集团畜牧兽医总站，
类型：发明
国别省市：北京;11