TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了TOX3基因在制备预测AML预后试剂盒中的应用，是基于本发明专利技术发明专利技术人首次发现AML患者外周血中TOX3基因的表达情况与AML患者的预后相关。当TOX3基因表达水平高时，表明AML患者临床预后差的可能性较大。TOX3基因的表达水平对于制定AML早期诊疗方案和有效的综合分层体系具有重要的指导意义，可为AML患者靶向治疗提供更多的临床预后研究资料，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用。
技术介绍
急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是成人白血病中最常见的类型，发病率为3.7/100000。目前AML的常规治疗是以最大程度耐受性的诱导缓解和缓解后治疗为基础，尽管近年来随着化疗方案的改进和造血干细胞移植技术的发展，对AML患者的治疗已取得一定的疗效，但还是存在着治疗缓解后高复发的风险以及无病生存率偏低的问题。研究表明，60岁以下患者5年总生存率约为40％，而60岁以上患者仅为10％-20％，20％初诊患者治疗后不能达到完全缓解(CR)，50％-70％CR患者仍将复发，少数CR后复发患者能存活五年以上。AML患者的不同预后提示其他关键因素(例如细胞免疫)也会影响治疗效果。众所周知，癌症的免疫逃避和异常的免疫监视在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。近年来有研究表明TOX与肿瘤的发生发展及促进T细胞耗竭密切相关。TOX(Thymocyteselection-associatedHMGBOX)基因编码的蛋白属于highmobilitygroupbox(HMG-box)蛋白超家族成员，该蛋白是一种与DNA结合的转录调节因子。人的TOX基因包含4个亚族基因：TOX，TOX2，TOX3，TOX4，分别位于人类不同的染色体上。TOX家族的四个成员各自有着不同的功能。近年来，有学者报道，TOX3可能参与了多种恶性肿瘤的形成。TOX3也称为TNRC9，位于人类16号染色体的q12.1上，最初在大脑中被发现，被视为神经元的重要保护因子。TOX3在不同的肿瘤中发挥的作用不尽相同。在乳腺癌中，TOX3的高表达与乳腺癌病人的风险密切相关。高表达TOX3的乳腺癌病人总体生存率(overallsurvival，OS)和远处无转移生存率(distantmetastasis-freesurvivaltimes，DMFS)都比低表达TOX3的乳腺癌病人低。而在肺癌病人中，TOX3却呈现出肿瘤抑制基因的功能。高表达TOX3的肺癌病人生存率比低表达的肺癌病人高。尽管TOX3与上述肿瘤的预后密切相关，但有关TOX3在血液肿瘤尤其是白血病中的作用仍不清楚。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用。当检测到外周血中高表达的TOX3时，表明AML患者的预后不良可能性大，可以作为预测AML患者预后评估的指标。本专利技术的另一目的在于提供一种预测AML预后的试剂盒。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用，是基于本专利技术的专利技术人首次发现AML患者外周血中TOX3表达情况与AML患者的预后相关。在所述的应用中，通过检测临床患者的外周血中TOX3基因的表达量，结合内参基因的表达量，进行统计学分析，得到临床患者的TOX3相较于健康成人的基因差异表达倍数，从而预测AML预后。所述的内参基因优选为β微球基因(β2M)。所述的统计学分析方法优选为ΔΔCT法；基因差异表达倍数＝2^(-ΔΔCT)，ΔΔCT＝ΔCT临床患者–ΔCT健康成人，ΔCT临床患者＝(CT基因-CT内参)，ΔCT健康成人＝(CT基因-CT内参)，CT基因和CT内参通过实时荧光定量PCR方法检测得到。所述的预测具体指：(1)当TOX3的基因差异表达倍数≥0.1820倍时，患者临床预后差的可能性较大；(2)当TOX3的基因差异表达倍数<0.1820倍时，患者临床预后好的可能性较大。所述的预后差具体是指3年OS率不高于4％。所述的预后好具体是指3年OS率不低于61％。一种预测AML预后的试剂盒，包括用于扩增TOX3cDNA的引物。所述的用于扩增TOX3cDNA的引物如下：TOX3-F:5'-TATGCCTCACACATCTCCTTCA-3'(SEQIDNO.1)；TOX3-R:5'-ATGGCTCTGTTGGCTTCATC-3'(SEQIDNO.2)。所述的试剂盒还包括用于扩增内参的引物，具体如下:β2M-F:5'-TACACTGAATTCACCCCCAC-3'(SEQIDNO.3)；β2M-R:5'-CATCCAATCCAAATGCGGCA-3'(SEQIDNO.4)。所述的试剂盒还包括用于分离外周血单个核细胞的试剂、用于总RNA提取的试剂、用于逆转录PCR(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)的试剂、用于实时定量PCR(quantitativerealtimePCR,qRT-PCR)的试剂中的任意一种或至少两种。所述的用于分离外周血单个核细胞的试剂优选为淋巴细胞分离液(Ficoll)。所述的用于总RNA提取的试剂优选为TRIZOL。上述预测AML预后的试剂盒在非疾病诊断检测TOX3表达中应用。所述的应用包括如下步骤：(1)取待测外周血样本，分离得到单个核细胞；(2)在步骤(1)得到的单个核细胞中加入总RNA提取的试剂，混匀；(3)加入氯仿，混匀后进行离心；(4)吸取上层液体，加入异丙醇后离心去上清；(5)乙醇洗涤，干燥，得到RNA样品；(6)将步骤(5)得到的RNA样品逆转录成cDNA；(7)将步骤(6)得到的cDNA，利用所述的试剂盒进行目的基因表达量检测。所述的单个核细胞、总RNA提取的试剂、氯仿的配比优选按5～10×106个细胞：1毫升：0.1～0.3毫升计算。步骤(2)中所述的总RNA提取的试剂优选为TRIZOL。步骤(3)中所述的离心的条件优选为：温度2～8℃、转速10000～15000g、时间15～30分钟。步骤(4)中所述的异丙醇用量优选按上层液体：异丙醇＝体积比1～2:1～2计算；优选按1:1计算。步骤(4)中所述的离心的条件优选为：温度2～8℃、转速10000～15000g、时间10～20分钟；步骤(5)中所述的乙醇洗涤的次数优选两次；更优选为，第一次优选用75％乙醇在-20℃条件下洗涤，第二次优选用100％乙醇在-20℃条件下洗涤，每次均匀混合30s后，2～8℃，8000～12000g离心5～10分钟。步骤(5)中所述的干燥优选为真空离心机干燥；条件优选为温度2～8℃、时间5～10分钟。步骤(6)中所述的逆转录通过用于逆转录PCR的试剂实现。步骤(7)中所述的目的基因表达量检测通过用于实时定量PCR的试剂实现。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术采用实时定量聚合酶链式反应(quantitativerealtimepolymerasechainreaction,qRT-PCR)检测AML患者外周血中TOX3基因的表达情况，首次发现TO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用。


2.根据权利要求1所述的TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用，其特征在于：通过检测临床患者的外周血中TOX3的表达量，结合内参基因的表达量，进行统计学分析，得到临床患者的TOX3相较于健康成人的基因差异表达倍数，从而预测AML预后。


3.根据权利要求2所述的TOX3在制备预测AML预后试剂盒中的应用，其特征在于：所述的内参基因为β2M；所述的统计学分析方法为ΔΔCT法；基因差异表达水平倍数＝2^(-ΔΔCT)，ΔΔCT＝ΔCT临床患者–ΔCT健康成人，ΔCT临床患者＝(CT基因-CT内参)，ΔCT健康成人＝(CT基因-CT内参)；CT基因和CT内参通过实时荧光定量PCR方法检测得到；所述的预测具体指：
(1)当TOX3的基因差异表达倍数≥0.1820倍时，患者临床预后差的可能性较大；
(2)当TOX3的基因差异表达倍数<0.1820倍时，患者临床预后好的可能性较大。


4.一种预测AML预后的试剂盒，其特征在于：包括用于扩增TOX3cDNA的引物。


5.根据权利要求4所述的预测AML预后的试剂盒，其特征在于：
所述的用于扩增TOX3cDNA的引物如下：
TOX3-F:5'-TATGCCTCACACATCTCCTTCA-3'；
TOX3-R:5'-ATGGCTCTGTTGGCTTCATC-3'。


6.根据权利要求5所述的预测AML预后的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于扩增内参的引物，具体如下:
β2M-F:5'-TACACTGAATTCACCCCCAC-3'；
β2M-R:5'-CATCCAATCCAAATGCGGCA-3'。


7.根据权利要求5或6所述的预测AML预后的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少华，梁朝峰，李扬秋，查显丰，黄舒欣，赵玉洁，谭家雄，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44