【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于蛋白质检测的数字化扩增相关申请的交叉引用本申请要求于2018年9月26日提交的美国临时申请第62/736,972号的权益，出于所有目的将其整体明确地并入本文中。序列表本申请包含已经以ASCII格式电子地递交的序列表，并通过引用在此将其整体并入。在2019年9月24日创建的所述ASCII副本被命名为39355-701_601_SL.txt，并且大小为2,585字节。背景数字化测定由于其稳健性、灵敏性和准确性而在生物学中变得越来越重要，在数字化测定中是基于对二进制是或否响应的计数而进行测量的。尽管模拟测量经常需要用运行的标准来校准，但是数字化测量不需要校准，并且具有比模拟方法更快、更容易实现、更准确和更稳健的潜力。考虑到模拟测定中固有的限制和现有数字化测定的技术限制，显然需要提供用于进行数字化蛋白质测定的改进的方法和设备。本文所述的专利技术解决了这种需要和更多的需要。概述本公开提供了用于进行测定的方法、系统和组合物。在各个方面，本公开涉及数字化测定，并且在具体方面涉及蛋白质测定，其可以使用扩增反应和/或在单个步骤或单个容器中进行。在一些方面，扩增反应是等温扩增反应。在某些方面，等温扩增是数字化等温扩增。在一些方面，扩增反应是PCR扩增。在某些方面，PCR扩增是数字化PCR扩增。在许多方面，本文所公开的测定在无洗涤步骤的情况下进行。本公开还涉及可以作为均质测定进行的测定，即没有反应剂附接于固体支持物的测定。在许多实施方案中，均质测定使用均质溶液，其可以是其中接近触发的扩增反应的所有...
【技术保护点】
1.用于蛋白质分析物数字化检测的方法，其包括：/n将流体分隔成多个区室化流体体积以形成均质测定，所述多个体积中的一些是区室化不含分析物的体积，而所述多个体积中的另一些体积是区室化含分析物的体积；和/n基于来自所述多个区室化体积的光学信号检测所述区室化含分析物的体积中所述分析物的存在，/n其中所述光学信号由所述区室化含分析物的体积中的接近诱导的相互作用触发的，所述区室化含分析物的体积包含所述分析物和所述区室化流体体积的组分，并且/n其中在检测所述光学信号存在时，所述多个区室化流体体积的每一个中的所述流体基本上由通过分隔步骤产生的各自的区室化流体体积和从其产生的反应产物组成。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180926 US 62/736,9721.用于蛋白质分析物数字化检测的方法，其包括：
将流体分隔成多个区室化流体体积以形成均质测定，所述多个体积中的一些是区室化不含分析物的体积，而所述多个体积中的另一些体积是区室化含分析物的体积；和
基于来自所述多个区室化体积的光学信号检测所述区室化含分析物的体积中所述分析物的存在，
其中所述光学信号由所述区室化含分析物的体积中的接近诱导的相互作用触发的，所述区室化含分析物的体积包含所述分析物和所述区室化流体体积的组分，并且
其中在检测所述光学信号存在时，所述多个区室化流体体积的每一个中的所述流体基本上由通过分隔步骤产生的各自的区室化流体体积和从其产生的反应产物组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个区室化流体体积中的每个流体体积包括：
包含被配置为与所述分析物结合的第一结合部分的第一探针，所述第一结合部分与第一核酸分子结合；和
包含被配置为与所述分析物结合的第二结合部分的第二探针，所述第二结合部分与第二核酸分子结合，并且
其中：
当与所述分析物结合时，在所述第一探针和所述第二探针之间发生所述接近诱导的相互作用；
所述接近诱导的相互作用触发扩增反应；和
所述光学信号是由在所述含分析物的体积中的所述扩增反应触发的荧光信号。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其还包括对其中产生荧光的体积数进行计数，从而产生样品的分析物计数。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分析物计数是基于泊松统计产生的。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述扩增反应是等温反应。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述扩增反应是数字化等温反应。
7.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述扩增反应是聚合酶链式反应。
8.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述扩增反应是数字化聚合酶链式反应。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法在无连接酶的情况下进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中当使用所述光学信号检测所述分析物的存在时，所述多个区室化体积中的每一个由通过所述分隔步骤产生的各自的区室化流体体积和从其产生的反应产物组成。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在将所述流体分隔成所述多个区室化流体体积之后，在所述方法的整个剩余部分中，每个流体体积被包含在单个容器内，直到使用所述光学信号检测到所述分析物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法在无洗涤步骤的情况下进行。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述光学信号是吸收信号或发光信号。
14.根据权利要求2-6或8-13中任一项所述的方法，其中所述接近诱导的相互作用和所述扩增反应均是等温反应。
15.根据权利要求2-6或8-14中任一项所述的方法，其中所述接近诱导的相互作用和所述扩增反应均是数字化等温反应。
16.根据权利要求2-4或6-13中任一项所述的方法，其中所述接近诱导的相互作用是等温反应，并且所述扩增反应是聚合酶链式反应。
17.根据权利要求2-4或6-13中任一项所述的方法，其中所述接近诱导的相互作用是数字化等温反应，并且所述扩增反应是数字化聚合酶链式反应。
18.根据权利要求2-13中任一项所述的方法，其中所述接近诱导的相互作用是链置换相互作用。
19.根据权利要求18所述的方法，其中：
在所述接近诱导的相互作用之前，所述第二核酸分子与不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合；
所述接近诱导的相互作用包括所述第一核酸与所述第二核酸之间的相互作用，其将所述阻断剂寡核苷酸置换到溶液中；
所述扩增反应包括在所述阻断剂寡核苷酸置换后诱导模板化聚合作用以延伸所述第一核酸分子；
每个流体体积包含产生切口的核酸内切酶，其被配置为切割延伸的第一核酸，以允许带切口部分释放到溶液中；以及
基于在所述含分析物的体积中的所述带切口部分的释放来触发荧光。
20.根据权利要求19所述的方法，其中：
所述扩增反应重复延伸所述第一核酸，并且所述产生切口的核酸内切酶重复切割所述延伸的第一核酸，从而导致带切口核酸链的积累；
每个流体体积含有多个荧光部分，其被配置为与积累的带切口核酸链结合；以及
通过所述荧光部分与所述积累的带切口核酸链的结合以及通过用与结合的荧光部分接近共振的光照射所述多个体积来触发所述荧光，从而从所述结合的荧光部分诱导荧光。
21.根据权利要求19所述的方法，其中：
每个流体体积包含多个辅助底物，所述辅助底物各自包含辅助核酸链；
所述辅助核酸链被配置为与所述延伸的第一核酸的带切口部分结合，从而在溶液中形成包含所述带切口部分和所述辅助核酸链的辅助核酸复合物；以及
所述辅助核酸复合物被配置为延伸所述带切口部分，并通过所述产生切口的核酸内切酶或聚合酶重复触发去除延伸的带切口部分的一部分，所述去除的延伸的带切口部分包括原始去除的带切口部分的拷贝。
22.根据权利要求21所述的方法，其中至少一些所述辅助底物各自与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述辅助核酸链被配置为与所述延伸的第一核酸的带切口部分结合，从而置换所述辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述多个辅助底物包括以下辅助底物：其被设计为与所述延伸的带切口部分结合并通过非生产性地延伸所述延伸的带切口部分来使所述延伸的带切口部分失活，以产生指数增长的阈值。
25.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，所述扩增反应选自：无酶发夹组装反应、无酶催化的发夹反应、无酶杂交链式反应和接近诱导的滚环扩增。
26.根据权利要求25所述的方法，其中：
所述扩增反应为滚环扩增；
所述第二探针包括滚环扩增底物，其包含与所述第二核酸分子结合的环状核酸链；和
所述环状核酸链包含结合所述第一核酸分子的第一结合位点和结合所述第二核酸分子的第二结合位点，所述环状核酸链在所述第一结合位点和所述第一核酸分子之间的亲和力等于或高于所述第二结合位点与所述第二核酸分子之间的亲和力。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述第二结合位点包含与所述第二核酸分子的相应核酸不互补的一个或多个错配核酸。
28.用于蛋白质分析物的数字化检测方法，其包括：
将流体分隔成多个区室化流体体积以形成均质测定，所述多个体积中的一些是区室化不含分析物的体积，而所述多个体积中的另一些是区室化含分析物的体积，并且每个区室化流体的体积还包含：
包含被配置为与所述分析物结合的第一结合部分的第一探针，所述第一结合部分与第一核酸分子结合，和
包含被配置为与所述分析物结合的第二结合部分的第二探针，所述第二结合部分与第二核酸分子结合；
通过所述第一核酸分子和所述第二核酸分子之间的接近诱导的相互作用，引起区室化含分析物的体积中的扩增反应；以及
基于所述扩增反应检测所述含分析物的体积中所述分析物的存在。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述扩增反应是等温扩增反应。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述扩增反应是数字化等温扩增反应。
31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述扩增是聚合酶链式反应。
32.根据权利要求28所述的方法，其中，所述扩增是数字化聚合酶链式反应。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中，检测所述分析物的存在包括：
用光照射所述多个区室化体积；和
从所述区室化含分析物的体积中检测荧光。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中，分隔步骤包括将每个区室化流体体积放入多个容器中各自的容器中，并且其中，每个区室化流体体积保持在其各自的容器中，直到已经进行了检测步骤为止。
35.根据权利要求28-34中任一项所述的方法，其中，所述接近诱导的相互作用触发其中所述第二核酸分子被延伸的扩增反应。
36.根据权利要求35所述的方法，其中使用所述第一核酸作为模板来延伸所述第二核酸分子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一核酸分子在所述接近诱导的相互作用之前与滚环底物结合，并且其中所述接近诱导的相互作用触发使用所述滚环底物作为模板的所述第二核酸分子的延伸。
38.根据权利要求28-37中任一项所述的方法，其中所述第一核酸在所述接近诱导的相互作用之前与可延伸底物结合，并且其中所述接近诱导的相互作用使所述可延伸底物释放到溶液中。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述可延伸底物的释放触发指数扩增反应。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述指数扩增反应是EXPonential扩增反应。
41.根据权利要求28-40中任一项所述的方法，其中，所述接近诱导的相互作用触发发夹组装反应。
42.根据权利要求28-41中任一项所述的方法，其中所述接近诱导的相互作用产生由所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的部分组成的催化表面。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述流体包含与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸偶联的辅助底物，并且其中所述催化表面置换所述辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸，从而触发涉及所述辅助底物的扩增反应。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述流体包含与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸偶联的滚环底物，并且其中所述催化表面置换所述辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸，从而触发涉及所述滚环底物的扩增反应。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述流体包含多个折叠的发夹分子，并且所述催化表面催化所述多个折叠的发夹分子中的至少一个的展开。
46.通过链置换扩增检测流体中分析物存在的方法，其包括：
在所述流体中的溶液中提供包含被配置为与所述分析物结合的第一结合部分的第一探针，所述第一结合部分与第一核酸分子缀合；
在所述流体中的溶液中提供包含被配置为与所述分析物结合的第二结合部分的第二探针，所述第二结合部分与第二核酸分子缀合，其中所述第二核酸分子与不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合；
通过所述第一探针和所述第二探针之间的接近诱导的相互作用将所述不可延伸的阻断剂寡核苷酸置换到溶液中；
诱导模板化聚合作用以延伸所述第一核酸分子；
基于所述第一核酸分子的延伸触发荧光的产生；和
基于荧光检测流体中的所述分析物。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·T·邱，彼得·艾伦，
申请(专利权)人：蓝普臻公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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