一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测HLA‑B*58:01基因的试剂盒及其方法，涉及基因检测技术领域，该试剂盒包括核酸组合1；所述核酸组合1包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的第一引物对。该引物对是针对HLA‑B*58:01基因的特异性位点、区域进行设计的，单个反应即可完成HLA‑B*58:01基因的有效检测，且检测的准确性高，大幅度降低了假阴性和假阳性结果的出现。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒及其方法
本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒及其方法。
技术介绍
主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称，人类的MHC被称为人类白细胞抗原(HumanLeukocyteAntigen，HLA)。HLA基因定位于人类第6号染色体短臂上，由一群密切连锁的复等位基因组成，包含约360万个碱基对，长约4MB，是当前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最为丰富的区域。HLA是细胞表面分子，主要参与T细胞活化的已加工过的抗原肽的呈递并在其中起重要作用，构成机体最重要的免疫系统之一。HLA包含HLA-I、HLA-II和HLA-III，也称作MHC-I、MHC-II和MHC-III。HLA-I主要包括HLA-A、HLA-B、HLA-C，位于HLA复合体远离着丝粒的一端；HLA-II主要包括HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP，位于HLA复合体近着丝粒的一端；III类基因区位于二者之间。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到28000多个(2020.12)，在HLA-I和HLA-II等位基因家族中HLA-B的多态性最显著。HLA基因复合体不仅是多基因的而且是多等位基因的，HLA基因的多态性决定了在个体间可以产生高度多样化的HLA蛋白，也决定了不同个体处理和呈递同一种抗原的能力不同，从遗传水平上调控免疫应答功能，从而使不同个体对同一种抗原的免疫应答可表现出个体差异。这种个体差异或产生保护性免疫，或形成免疫耐受，或出现自身免疫倾向，或表现为HLA相关疾病。药物不良反应(AdverseDrugReaction，ADR)己经成为许多国家重要的致病甚至致死原因，皮肤不良反应是药物不良反应中的重要一部分，约占药物不良反应的三分之一。皮肤不良反应在临床上最常见的主要包括轻度的斑丘疹(MPE)、Stevens-Johnson综合征(SJS)、中毒性表皮坏死松懈症(TEN)。其中SJS和TEN是严重的皮肤和黏膜反应，可导致永久性残疾甚至致命，SJS致死率约为5％，TEN致死率则高达25～50％。皮肤不良反应大部分患者主要和以下这些药物相关：别嘌呤醇(Allopurinol)、卡马西平(Carbamazepine)、奥卡西平(Oxcarbazepine)、苯妥英(Phenytoin)、拉莫三嗪(Lamotrigine)、苯巴比妥(Phenobarbital)以及磺胺类抗菌素等。研究表明，中国大陆高尿酸血症的患病率13.3％，患病人数已经超过1.2亿；中国大陆痛风的患病率为1.1％，患病人数已经超过1700万。别嘌呤醇(Allopurinol)为次黄嘌呤的异构体，是黄嘌呤氧化酶的抑制剂，主要用于阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，从而减少尿酸的生成，是高尿酸血症和痛风患者降尿酸治疗的一线用药。别嘌呤醇疗效显著、价格低廉，但在中国人群中使用时易发生别嘌醇超敏反应，研究表明中国台湾地区超敏反应发生率为2.7％，别嘌醇超敏反应一旦发生，致死率高达30％。研究表明，别嘌呤醇不良反应的发生与HLA-B*58:01存在明显相关性，而汉族人群携带HLA-B*58:01基因型的频率为10％～20％。HLA-B*58:01等位基因与别嘌呤醇引发的SJS或TEN的强相关性在中国(包括台湾和香港地区)、泰国、新加坡、韩国等国家地区的多个研究小组的汉族人群中得到证实。几乎所有副反应的患者都是HLA-B*58:01的携带者，而别嘌呤醇耐受者中只有15％左右的HLA-B*58:01携带者。国内外相关指南均指出，亚裔人群在使用别嘌呤醇之前应进行HLA-B*58:01基因检测，对于HLA-B*58:01阳性患者，均不推荐使用别嘌呤醇。目前，HLA等位基因分型的常用方法主要包括：基于测序分型的聚合酶链式反应法(PCR-SBT)，PCR-SBT直接测序法是公认的HLA基因分型方法的"金标准"，其通过一对扩增引物、多个测序引物和组特异性测序引物进行DNA序列分析，使用特定软件分析确定基因型别。其主要应用于HLA基因分型，具有特异性强、灵敏度高等优点。但PCR-SBT存在着操作繁琐、耗时长，测序结果会出现套峰，会出现模棱两可的结果，不利于结果的判读；序列特异性寡核苷酸探针法(PCR-SSOP)，PCR-SSOP技术先通过对HLA等位基因的多态区域进行扩增，并对产物进行标记，然后针对扩增产物设计不同的寡核苷酸探针固定在膜上，将产物与膜上的特异性探针杂交并显色，根据信号判断实验结果。该技术特异性较强、灵敏度较高，需要的样本量少。由于其所用的载体大多为膜或微滴定板，且需大量探针及单独的杂交反应，因此流程繁琐，难以标准化和自动化。序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)，PCR-SSP技术是根据HLA等位基因特异性序列设计引物，直接扩增基因组DNA，通过凝胶电泳检测扩增产物，根据产物的有无和DNA片段大小来判断HLA基因型。该技术条件容易掌握、操作简便，需要的样本量少、对血液条件要求不高，适用于临床对于已知HLA序列的快速检测应用等优势；但由于PCR-SSP技术需使用凝胶电泳实验，因此该技术在操作中易造成二次污染、时间长，同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物，从而易造成假阳性结果等。环介导等位基因扩增反应(LAMP)，LAMP在等温条件下高度特异、高效且快速地扩增DNA。在目的DNA序列上，这种方法主要采用一种具有链置换性质的DNA聚合酶和4条特异性引物来识别DNA靶序列上的6个特异区域，从而进行循环扩增。靶序列的扩增反应需要在等温条件下进行大约1小时，可实现指数倍数的扩增。LAMP灵敏度高，临床使用时不需特殊仪器，操作简单，在63℃-65℃之间的恒温条件下即可完成DNA序列的扩增。但LAMP技术在操作时不能避免二次开盖，容易形成气溶胶造成污染，并且假阳性问题比较严重。实时荧光定量PCR(RT-PCR)，RT-PCR是在PCR过程中加入了荧光基团或者荧光染料指示剂，对PCR产物进行标记跟踪，利用信号积累实时监测PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析和计算。RT-PCR在反应的对数期检测，分析起始点产物的量、实时监测荧光信号、动力学范围广、有效鉴别非特异性扩增和突变、可以相对定量和绝对定量。因此，该技术灵敏度高、特异性强、能进行多重反应、自动化程度高、污染性小、具有实时性和准确性。目前，国内HLA-B*58:01等位基因的检测技术以PCR-SSP和RT-PCR这两种方法为主，检测目标分为检测HLA-B*58:01的关联位点和直接检测HLA-B*58:01基因两种。由于HLA-B等位基因数量庞大、结构复杂，目前可查的HLA-B*58:01基因检测专利及相关试剂盒多采用检测HLA-B*58:01等位基因连锁SNP位点的方法(CN109251973A、CN106701934B、CN110923314A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒，其特征在于，其包括核酸组合1；/n所述核酸组合1包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的第一引物对。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒，其特征在于，其包括核酸组合1；
所述核酸组合1包括核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示的第一引物对。


2.根据权利要求1所述的用于检测HLA-B*58:01的试剂盒，其特征在于，所述核酸组合1还包括核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的第一探针。


3.根据权利要求1所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测内参基因的核酸组合2；
优选地，所述核酸组合2包括核苷酸序列如SEQIDNo.4～5所示的第二引物对。


4.根据权利要求3所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒，其特征在于，所述核酸组合2还包括核苷酸序列如SEQIDNo.6所示探针2。


5.根据权利要求1～4任一项所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液。


6.根据权利要求1～4任一项所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预处理试剂A和预处理试剂B；
所述预处理试剂A包括：蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、Triton-X-100和水；
所述预处理试剂B包括：NaCl、Tris-HCL、NaOH、EDTA、SDS和水。


7.一种用于检测HLA-B*58:01基因的方法，其特征在于，所述方法包括采用如权利要求1～6任...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：为朔医学数据科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11