本发明专利技术涉及一种密码子优化的COL7A1基因序列，该基因序列是与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。Western Blot检测结果显示：密码子优化COL7A1基因表达水平明显高于野生型COL7A1基因。携带密码子优化COL7A1基因的慢病毒感染人表皮干细胞后，能成功地在体外培养形成表皮片。因此，携带密码子优化COL7A1基因的慢病毒可作为RDEB基因治疗药物，可用于建立结合LV和表皮干细胞二者优势的RDEB临床治疗产品。
【技术实现步骤摘要】
一种密码子优化的COL7A1基因及慢病毒和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种密码子优化的COL7A1基因及慢病毒和应用。
技术介绍
人类皮肤由表皮(epidermis)、真皮(dermis)、皮下组织和皮肤附属器构成。基底膜带(basementmembranezone,BMZ)位于表皮和真皮之间，是表皮与真皮之间的连接结构。遗传性大疱性表皮松解症(epidermolysisbullosa,EB)是由于BMZ的结构异常而引起的、以表皮和真皮之间出现水疱和血疱为特征的单基因遗传病，可分为四大类：单纯性大疱性表皮松解症(epidermolysisbullosasimplex,EBS)；交界型大疱性表皮松解症(junctionalepidermolysisbullosa，JEB)；营养不良型大疱性表皮松解症(dystrophicepidermolysisbullosa，DEB)；Kindler综合征。国际上不同国家和地区的流行病学调查显示EB患病率在10万分之2-5，据此推算我国患病人数约在3-7万，全球患病人数可能在20-40万级别，其中40％以上是隐性营养不良型大疱性表皮松解症(recessivedystrophicepidermolysisbullosa,RDEB)。RDEB患者临床表现差异较大，包括仅累及手脚皮肤到伤及内脏粘膜以及角膜，甚至危及患者生命。目前为止还没有有效治疗手段，通常采取对症和支持治疗。细胞治疗、蛋白替代治疗和基因治疗都在进行尝试。其中基于表皮干细胞(epidermalstemcells,EpSCs)的基因治疗有望成为EB的有效治疗措施。国际上EB的基因治疗临床试验主要聚焦到JEB和RDEB。RDEB(隐性营养不良型)是由VII型胶原COL7A1基因突变造成。COL7A1胶原是锚原纤维(anchoringfibrils,AFs)的主要组份，AFs在维持表皮和真皮之间的连接起到至关重要的作用，因此，COL7A1基因突变导致表皮与真皮之间结构稳态丧失。人COL7A1基因座全长32kb，位于三号染色体3p21，由118个外显子构成，mRNA转录本约8.9kb，编码含有2944个氨基酸的蛋白。目前COL7A1基因已报道700多个突变，大部分呈隐性遗传，小部分表现为显性遗传。表皮干细胞(epidermalstemcells,EpSCs)位于表皮的基底层，负责维持表皮的周期性角化过程。表皮干细胞的体外培养扩增和克隆分析方法是哈佛医学院的HowardGreen及其团队上世纪70-80年代建立的，用于评估EpSCs在体外的干性(stemness)和生长潜能。EpSCs在体内能够重建完整表皮，在体外表现为完全克隆(holoclone)生长方式。婴幼儿表皮细胞以EpSCs为主，体外呈现为完全克隆，老年人的EpSCs的比例很低，体外多呈现为部分克隆(meroclone)和终末克隆(paraclone)。单个表皮干细胞在体外扩增的子代细胞能够满足大面积烧伤病人的表皮重建，也已在累及EpSCs的单基因遗传病如EB的基因治疗中显示出了强大的作用。RDEB可以通过间接体内(exvivo)的方式进行治疗，也就是获取患者的EpSCs，体外扩增，通过基因转移技术补偿表达正常的COL7A1基因，在体外培养成表皮的皮瓣，移植到患病部位，持续恢复患者的皮肤结构，实现长期治愈。该策略有几个优势：1)自体细胞，无免疫原性；2)EpSCs可大量体外扩增且能维持干性，理论上一个EpSCs的子代细胞可满足全身治疗；3)外源基因整合位点可明确定位，基因转移造成的基因组毒性降到最低；4)局部表皮治疗，风险低；5)成药形式是携带正常基因的慢病毒载体质粒，可规模化生产，用于所有RDEB患者。国际上已开展的RDEB细胞基因治疗临床试验采用基因替代(genereplacement)策略，主要有两种方式：“RV介导的自体表皮干细胞exvivo基因纠正的表皮片移植疗法”和“LV介导的自体皮肤成纤维细胞exvivo基因纠正的皮下细胞注射疗法”。作为基因替代导入载体，LV(慢病毒载体质粒)与RV(逆转录病毒载体)相比具有安全性更高、容量更大、适用性更广等优势；与皮肤成纤维细胞的注射治疗相比，表皮干细胞的皮片移植法安全性高、治疗面积大、效果持久以及患者创伤和痛苦小。RV和成纤维细胞注射方案的不足，限制了已有的临床试验疗法的应用前景。但是，目前尚无LV结合表皮干细胞的基因治疗产品和技术。建立结合LV和表皮干细胞二者优势的RDEB临床治疗产品和技术是本项目拟解决的关键技术问题之一。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种密码子优化的COL7A1基因，相比野生型COL7A1基因，可显著提高COL7A1蛋白的表达水平；此外，本专利技术还提供一种基于密码子优化的COL7A1基因的慢病毒载体质粒以及慢病毒用作RDEB基因治疗药物，在对慢病毒纯化过程中采用独创的纯化方法，得到高纯度高滴度的慢病毒假病毒，填补了LV结合表皮干细胞的基因治疗技术空白。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：第一方面，本专利技术提供一种密码子优化的COL7A1基因序列，该基因序列是与SEQIDNO:1所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。优选地，密码子优化的COL7A1基因与SEQIDNO:1所示序列具有至少85％同源性，更优选是与SEQIDNO:1所示序列具有至少90％同源性；再优选为与SEQIDNO:1所示序列具有至少95％或至少98％的同源性。第二方面，本专利技术提供一种携带密码子优化的COL7A1基因的慢病毒载体质粒，其包括：含有EFS启动子的慢病毒载体基因组和用于编码的密码子优化COL7A1基因序列；其中，含有EFS启动子的慢病毒载体基因组序列如SEQIDNo:3所示；密码子优化COL7A1基因序列是与SEQIDNO:1所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。优选地，密码子优化的COL7A1基因与SEQIDNO:1所示序列具有至少85％同源性，更优选是与SEQIDNO:1所示序列具有至少90％同源性；再优选为与SEQIDNO:1所示序列具有至少95％同源性。第三方面，本专利技术提供一种密码子优化的COL7A1基因慢病毒载体质粒的构建方法，该方法是将编码密码子优化的COL7A1基因片段亚克隆至pCCL-EFS质粒中，得到pCCL-EFS-COL7A1-OPT质粒；包括如下步骤：(1)将pCCL-EFS质粒用限制性内切酶EcoRI和SalI于于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-EFS载体片段；将编码密码子优化的COL7A1基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和EcoRI/SalI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用EcoRI和SalI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收密码子优化的COL7A1基因片段；(2)将胶回收试剂盒回收的pCCL-EFS载体片段和密码本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种密码子优化的COL7A1基因序列，其特征在于，该基因序列是与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。/n
【技术特征摘要】
1.一种密码子优化的COL7A1基因序列，其特征在于，该基因序列是与SEQIDNO:1所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
2.一种携带密码子优化的COL7A1基因的慢病毒载体质粒，其特征在于，其包括：含有EFS启动子的慢病毒载体基因组和用于编码的密码子优化COL7A1基因序列；其中，含有EFS启动子的慢病毒载体基因组序列如SEQIDNo:3所示；密码子优化COL7A1基因序列是与SEQIDNO:1所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
3.一种权利要求2所述的密码子优化的COL7A1基因慢病毒载体质粒的构建方法，该方法为：将编码密码子优化的COL7A1基因片段亚克隆至pCCL-EFS质粒中，得到pCCL-EFS-COL7A1-OPT质粒；包括如下步骤：
(1)将pCCL-EFS质粒用限制性内切酶EcoRI和SalI于于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-EFS载体片段；
将编码密码子优化的COL7A1基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和EcoRI/SalI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用EcoRI和SalI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收密码子优化的COL7A1基因片段；
(2)将胶回收试剂盒回收的pCCL-EFS载体片段和密码子优化的COL7A1基因片段，采用T4DNA连接酶连接，室温反应10-20min；
(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培养12-16h；
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-EFS-COL7A1-OPT质粒，以EcoRI和SalI双酶切初步鉴定后进行DNA测序鉴定，至此慢病毒表达载体质粒构建成功。
4.一种携带密码子优化的COL7A1基因的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒包含Lentivirus衣壳、包装在衣壳中的Lentivi...
【专利技术属性】
技术研发人员：董文吉，张艳君，刘子瑾，程谟斌，赵忠亮，
申请(专利权)人：中吉智药南京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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