微流控芯片检测17种番茄病原物的方法及引物技术

发明专利技术公开了微流控芯片检测17种番茄病原物的方法及引物。本发明专利技术所要保护的一个技术方案是鉴定或辅助鉴定番茄病害病原物的组合物，所述组合物由序列表中SEQ ID No.1‑34中的17种引物对中的n种引物对组成，n为17至1中的任一自然数。将鉴定或辅助鉴定番茄病害病原物的组合物加入微流控芯片进行荧光PCR反应，通过对PCR产物的荧光信号进行读取，可以完成17种常见番茄病害病原物的检测。检测的灵敏度高特异性强，有利于番茄病原物的快速鉴定。

【技术实现步骤摘要】
微流控芯片检测17种番茄病原物的方法及引物
本专利技术属于微生物分子检测领域，具体涉及微流控芯片检测17种番茄病原物的方法及引物。
技术介绍
番茄是世界上消费量仅次于马铃薯的蔬菜。随着番茄栽培面积的不断扩大和种植年限的增加，番茄上的病害发展具有逐年加重的趋势。据报道，侵染番茄的病原物有200多种，包括真菌、细菌、病毒和线虫。生产上番茄经常发生的病害主要包括由茄链格孢(Alternariasolani，As)侵染引起的早疫病、由多主棒孢(Corynesporacassiicola，Cc)侵染引起的棒孢叶斑病、由灰葡萄孢(Botrytiscinerea，Bc)侵染引起的灰霉病、由辣椒疫霉(Phytophthoracapsici，Phc)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum，Pa)和茄病镰孢(Fusariumsolani，Fs)侵染引起的根腐病、由茄匍柄霉(Stemphyliumsolani，Sts)侵染引起的灰叶斑病、由尖孢镰孢(Fusariumoxysporum，Fo)侵染引起的枯萎病、由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum，Scs)侵染引起的菌核病、由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani，Rhs)侵染引起的立枯病、由煤污假尾孢(Pseudocercosporafuligena，Pf)引起的煤污病等真菌性病害；由丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato，Pst)侵染引起的细菌性斑点病、茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum，Ras)引起的青枯病、密执安棍状杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis，Cmm)引起的溃疡病、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum，Pcc)软腐病以及由野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria，Xcv)引起的疮痂病等细菌性病害；由番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)等侵染引起的番茄病毒病。这些病原物均可以侵染番茄，对番茄的产量和品质造成严重的影响，严重阻碍了番茄的正常生产，给广大农民造成巨大的经济损失。由于一些病原物在番茄上引起的症状具有一定的相似性，非常容易造成对病害的错误诊断，从而导致防治方法的不恰当。因此，准确鉴定发病番茄上的多种病原物，尤其是在发病初期进行检测尤为重要。传统的对植物病原物的检测方法如显微镜检查，培养形态鉴定等不仅费时费力，并且对诊断人员的专业知识要求也高，且这些方法对细菌和病毒并不适用。免疫检测技术可以有效的对病原物进行鉴定，但也存在灵敏性低、易产生假阳性的缺陷。近些年发展起来的分子生物学技术，逐渐用于检测植物上的病原物。如经典PCR技术、巢氏PCR技术、荧光定量PCR检测技术、随机扩增多态性DNA标记检测技术、等温扩增检测技术等，已经用于植物病原真菌、细菌和病毒的检测。目前，番茄上的多种病原物已经建立了分子生物学检测技术，可以在4小时内实现对单个样本的检测，准确性和灵敏性基本满足实际的需要。但是，以上方法只能针对其中一种或少数几种病原物同时鉴定，容易漏检番茄植株上其他的病原物。多重PCR可以一个反应管中检测多个靶标，但一次性可检测到靶标一般不超过6个。由于田间番茄植株病害的频发和多种病害复合发生的现象较多，亟需一种可同时检测多种病原物的方法。微流控芯片(Microfluidic)，又称微型全分析系统(MiniaturizedTotalAnalysisSystems，TAS)或芯片实验室，是通过分析化学、微机电加工(MEMS)、计算机、电子学、材料学及生物学、医学的交叉实现从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化和便携化。微流控芯片分析系统的特点是分析速度快、灵敏度高、选择性高、微型化等，常用的检测方法主要有电化学检测、质谱检测和光学检测等方法。目前，微流控芯片已经在基因检测、蛋白质和氨基酸分析、细胞分析、免疫分析、单分子检测、药物分析与筛选、酶分析等方面得到了广泛的应用。在微生物检测方面，微流控芯片检测技术已经用于人类、水生生物以及食品相关方面的检测。而在植物病原物检测方面，已有研究人员将其运用于植物病原线虫的检测，但还未见应用于对其他植物病原物微生物如真菌、细菌以及病毒等检测的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何同时检测常见侵染番茄的17种病原物或如何提高侵染番茄病原物的检测效率。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了鉴定或辅助鉴定番茄病害病原物的组合物。所述组合物由下述17种引物对中的n种引物对组成，n可为17至1中的任一自然数：A1)由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条单链DNA分子组成的编号为N23_1A的引物对；或由SEQIDNo.1的第22-42位核苷酸和SEQIDNo.2所示的单链DNA分子组成的引物对；A2)由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条单链DNA组成的编号为N23_2A的引物对；或由SEQIDNo.3的第22-41位核苷酸和SEQIDNo.4所示的单链DNA分子组成的引物对；A3)由SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的两条单链DNA组成的编号为N23_3A的引物对；或由SEQIDNo.5的第22-46位核苷酸和SEQIDNo.6所示的单链DNA分子组成的引物对；A4)由SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的两条单链DNA组成的编号为N23_4A的引物对；或由SEQIDNo.7的第22-46位核苷酸和SEQIDNo.8所示的单链DNA分子组成的引物对；A5)由SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的两条单链DNA组成的编号为N23_5B的引物对；或由SEQIDNo.9的第22-47位核苷酸和SEQIDNo.10所示的单链DNA分子组成的引物对；A6)由SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的两条单链DNA组成的编号为N23_6B的引物对；或由SEQIDNo.11的第22-47位核苷酸和SEQIDNo.12所示的单链DNA分子组成的引物对；A7)由SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的两条单链DNA组成的编号为N23_7D的引物对；或由SEQIDNo.13的第22-43位核苷酸和SEQIDNo.14所示的单链DNA分子组成的引物对；A8)由SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示的两条单链DNA组成的编号为N23_8B的引物对；或由SEQIDNo.15的第22-46位核苷酸和SEQIDNo.16所示的单链DNA分子组成的引物对；A9)由SEQIDNo.17和SEQIDNo.18所示的两条单链DNA组成的编号为N23_9A的引物对；或由SEQIDNo.17的第22-48位核苷酸和SEQIDNo.18所示的单链DNA分子组成的引物对；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鉴定或辅助鉴定番茄病害病原物的组合物，其特征在于：所述组合物由下述17种引物对中的n种引物对组成，n为17至1中的任一自然数：/nA1)由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA分子组成的编号为N23_1A的引物对；或由SEQ ID No.1的第22-42位核苷酸和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA2)由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成的编号为N23_2A的引物对；或由SEQ ID No.3的第22-41位核苷酸和SEQ ID No.4所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA3)由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成的编号为N23_3A的引物对；或由SEQ ID No.5的第22-46位核苷酸和SEQ ID No.6所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA4)由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成的编号为N23_4A的引物对；或由SEQ ID No.7的第22-46位核苷酸和SEQ ID No.8所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA5)由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成的编号为N23_5B的引物对；或由SEQ ID No.9的第22-47位核苷酸和SEQ ID No.10所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA6)由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成的编号为N23_6B的引物对；或由SEQ ID No.11的第22-47位核苷酸和SEQ ID No.12所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA7)由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成的编号为N23_7D的引物对；或由SEQ ID No.13的第22-43位核苷酸和SEQ ID No.14所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA8)由SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA组成的编号为N23_8B的引物对；或由SEQ ID No.15的第22-46位核苷酸和SEQ ID No.16所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA9)由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的两条单链DNA组成的编号为N23_9A的引物对；或由SEQ ID No.17的第22-48位核苷酸和SEQ ID No.18所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA10)由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的两条单链DNA组成的编号为N23_10D的引物对；或由SEQ ID No.19的第22-43位核苷酸和SEQ ID No.20所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA11)由SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的两条单链DNA组成的编号为N23_11A的引物对；或由SEQ ID No.21的第22-44位核苷酸和SEQ ID No.22所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA12)由SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的两条单链DNA组成的编号为N23_12C的引物对；或由SEQ ID No.23的第22-44位核苷酸和SEQ ID No.24所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA13)由SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示的两条单链DNA组成的编号为N23_13E的引物对；或由SEQ ID No.25的第22-45位核苷酸和SEQ ID No.26所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA14)由SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的两条单链DNA组成的编号为N23_14A的引物对；或由SEQ ID No.27的第22-46位核苷酸和SEQ ID No.28所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA15)由SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示的两条单链DNA组成的编号为N23_15B的引物对；或由SEQ ID No.29的第22-47位核苷酸和SEQ ID No.30所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA16)由SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示的两条单链DNA组成的编号为N23_16A的引物对；或由SEQ ID No.31的第22-44位核苷酸和SEQ ID No.32所示的单链DNA分子组成的引物对；/nA17)由SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的两条单链DNA组成的编号为N23_17B的引物对；或由SEQ ID No.33的第22-44位核苷酸和SEQ ID No.34所示的单链DNA分子组成的引物对；/n所述病原物为丁香假单胞菌...

【技术特征摘要】
1.鉴定或辅助鉴定番茄病害病原物的组合物，其特征在于：所述组合物由下述17种引物对中的n种引物对组成，n为17至1中的任一自然数：
A1)由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条单链DNA分子组成的编号为N23_1A的引物对；或由SEQIDNo.1的第22-42位核苷酸和SEQIDNo.2所示的单链DNA分子组成的引物对；
A2)由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条单链DNA组成的编号为N23_2A的引物对；或由SEQIDNo.3的第22-41位核苷酸和SEQIDNo.4所示的单链DNA分子组成的引物对；
A3)由SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的两条单链DNA组成的编号为N23_3A的引物对；或由SEQIDNo.5的第22-46位核苷酸和SEQIDNo.6所示的单链DNA分子组成的引物对；
A4)由SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的两条单链DNA组成的编号为N23_4A的引物对；或由SEQIDNo.7的第22-46位核苷酸和SEQIDNo.8所示的单链DNA分子组成的引物对；
A5)由SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的两条单链DNA组成的编号为N23_5B的引物对；或由SEQIDNo.9的第22-47位核苷酸和SEQIDNo.10所示的单链DNA分子组成的引物对；
A6)由SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的两条单链DNA组成的编号为N23_6B的引物对；或由SEQIDNo.11的第22-47位核苷酸和SEQIDNo.12所示的单链DNA分子组成的引物对；
A7)由SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的两条单链DNA组成的编号为N23_7D的引物对；或由SEQIDNo.13的第22-43位核苷酸和SEQIDNo.14所示的单链DNA分子组成的引物对；
A8)由SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示的两条单链DNA组成的编号为N23_8B的引物对；或由SEQIDNo.15的第22-46位核苷酸和SEQIDNo.16所示的单链DNA分子组成的引物对；
A9)由SEQIDNo.17和SEQIDNo.18所示的两条单链DNA组成的编号为N23_9A的引物对；或由SEQIDNo.17的第22-48位核苷酸和SEQIDNo.18所示的单链DNA分子组成的引物对；
A10)由SEQIDNo.19和SEQIDNo.20所示的两条单链DNA组成的编号为N23_10D的引物对；或由SEQIDNo.19的第22-43位核苷酸和SEQIDNo.20所示的单链DNA分子组成的引物对；
A11)由SEQIDNo.21和SEQIDNo.22所示的两条单链DNA组成的编号为N23_11A的引物对；或由SEQIDNo.21的第22-44位核苷酸和SEQIDNo.22所示的单链DNA分子组成的引物对；
A12)由SEQIDNo.23和SEQIDNo.24所示的两条单链DNA组成的编号为N23_12C的引物对；或由SEQIDNo.23的第22-44位核苷酸和SEQIDNo.24所示的单链DNA分子组成的引物对；
A13)由SEQIDNo.25和SEQIDNo.26所示的两条单链DNA组成的编号为N23_13E的引物对；或由SEQIDNo.25的第22-45位核苷酸和SEQIDNo.26所示的单链DNA分子组成的引物对；
A14)由SEQIDNo.27和SEQIDNo.28所示的两条单链DNA组成的编号为N23_14A的引物对；或由SEQIDNo.27的第22-46位核苷酸和SEQIDNo.28所示的单链DNA分子组成的引物对；
A15)由SEQIDNo.29和SEQIDNo.30所示的两条单链DNA组成的编号为N23_15B的引物对；或由SEQIDNo.29的第22-47位核苷酸和SEQIDNo.30所示的单链DNA分子组成的引物对；
A16)由SEQIDNo.31和SEQIDNo.32所示的两条单链DNA组成的编号为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宝聚，柴阿丽，康华军，石延霞，谢学文，李磊，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11