高通量测量方法、引物及组合、试剂盒和样本判断方法技术

本发明专利技术提供一种高通量测量方法、引物及组合、试剂盒和样本判断方法，通过设计TREC和KREC的断点引物，其中扩增TREC时在α和δ基因簇上的signal‑joint环断点为chr14:22386826‑22386826和chr14:22475315‑22475315，坐标分别为chr14:21621904‑22552132和chr14:22422546‑22466577；其中扩增KREC时的断点分别为chr2:88832772‑88832772和chr2:88859608‑88859608；在此基础上，采用二代测序技术同时对TREC和KREC扩增产物的含量进行检测，相互验证，可以提高检测的准确性和检测效率。

【技术实现步骤摘要】
高通量测量方法、引物及组合、试剂盒和样本判断方法
本专利技术涉及基因检测领域，特别是一种全基因组变异检测技术。
技术介绍
原发性免疫缺陷病(primaryimmunodeficiencydisease，PID)是一类由于基因缺陷造成的免疫系统损伤性疾病，多数为单基因缺陷，如不及时诊治，大部分患儿将在年幼时发生反复严重感染，甚至死亡。随着实验手段不断进步，包括DNA及RNA分析技术等，越来越多的PID建立了特异的筛查手段，包括SCID、X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)及家族性噬血细胞淋巴组织细胞增生综合征(familialhemophagocyticlymphohistiocytosis，FHL)等。其中基于TREC和KREC作为生物标记物来检测PID成了主流方案。TCR(T细胞受体)由4条多肽链α、β、γ、δ组成，每条链由相应的基因编码。其基因组成包括可变区(V)、多样区(D)、连接区(J)和恒定区(C)。TCR依多肽链结构及编码基因的不同，可分为αβ-TCR和γδ-TCR两种不同类型。大多数(约95％)为αβ-TCR，少数(约5％)为γδ-TCR。α链是由V、J、C基因节段编码的肽链，β链是由V、D、J、C基因节段编码的肽链。胸腺是T细胞分化、成熟的部位，从骨髓迁入胸腺的前T细胞抗原受体基因处于胚系状态，由一系列不连续的片段构成，包括V、J、D、C区，此时无基因重排，无功能表达。在前T细胞到达胸腺后，来自不同区域的片段随机重排，形成具有编码功能的V-(D)-J序列。TCR-α或TCR-γ由V-J基因重排产生，TCR-β或TCR-δ由V-D-J基因重排产生。TCR基因的重排一般分为两个阶段。首先是V/J或V/D/J片段重排，结合起来形成完整的V区编码序列。然后与编码TCR多肽链C区的DNA相接合，再在RNA水平上经过转录，拼接形成完整和连续编码的TCRmRNA序列(V和C区)。TCR-V基因(V/J或V/D/J)连接过程中，有两个保守序列存在。第一个是出现在J基因5’端的由7个核苷酸组成的七聚体CACAGTG。它和V基因片段的3’端七聚体互补。第二个是J片段的七个聚体3′端相隔23个核苷酸残基出现的九聚体TGTTTTTGG，它互补于V片段七聚体3’端相隔12个核苷酸的九聚体序列。这些保守序列以12或23个核苷酸相隔的规律出现(12/23规则)。很可能是通过七聚体、九聚体的互补而形成茎状或环状结构，使V-J或V-D-J序列靠拢，然后在重组酶的作用下而连接，去除茎和环部的序列，形成重排后新的DNA序列。这些被去除的DNA序列即TREC(T细胞受体切除环)。在αβT细胞中，重排TCR-α和TCR-β的基因都能产生TREC。因TCR-δ位于TCR-α位点内，所以TCRα基因重排前必须去除TCR-δ。大部分TCR-δ基因位于δRec与ψJα之间，且δRec-ψJα重排占所有δRec重排事件中的67％，因而δRec重排产生的信号和编码连接TREC，被用于说明胸腺干细胸的功能。人类TCR-δ基因位于TCR-α基因内，在Vα与Jα基因间。由于等位基因排斥(AllelicExclusion)机制，因此在TCRα基因重排前TCRδ基因必须被去除。在人类δRec-ψJα重排可以去除大部分的TCR-δ基因，从而为TCR-α基因重排(即Vα-Jα重排)作准备。δRec-ψJα重排产生一个信号连接TREC，Vα-Jα重排产生第二个TREC即编码连接TREC。TREC是稳定的，在有丝分裂期间不增殖，因此随每一次细胞分裂而被稀释。且信号和编码连接TREC对处女αβT细胞是特异的。于是，TREC即能作为细胞增殖历史的标记，又能说明胸腺干细胞的活性。B细胞早期成熟发育过程中亦可产生类似于TREC的DNA片段，即kapa重排剪切环(k-deletingrecombinationexcisioncircles，KREC)，同TREC性质相仿，KREC可作为近期骨髓输出B细胞的标志，因此可以筛查一部分B细胞发育缺陷。KREC形成的过程发生了2次重排，第一次是Vk和Jk片段之间的序列被删除，形成了Vk-Jk的codingjoint和游离的DNAsignaljoint环；第二次是intronRSS位点和Kde位点之间的序列被删除，形成了基因组上的codingjoint序列和游离的KRECsignaljoint环。2011年，Nakagawa等建立了纸片法检测KREC的方法，并检测了30例XLA及5例非XLA患者，结果均为阳性。XLA特指因BTK基因突变导致的X连锁的无丙种球蛋白血症，非XLA指非BTK基因突变所致的无丙种球蛋白血症，其成熟B细胞≤2％，两者均为早期B细胞发育缺陷所致，共占B细胞缺陷的20％。据估计，SCID和XLA共同的发病率为1/50000～1/30000，而TREC及KREC检测方法及原理基本相同，因此同时检测TREC及KREC不仅可扩大疾病筛查谱，而且整体上可以提高NBS的成本效益。TREC和KREC含量的检测方法较多，目前比较常用的方法包括实时定量PCR、竞争定量PCR及PCR-ELISA(在PCR扩增以后，在微孔板上借用酶联免疫吸附试验(ELISA)的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量)，其中最敏感和最常用的方法为实时定量PCR。实时定量PCR检测TREC和KREC的关键在于引物设计。对于TREC，在δ-Rec基因片段的下游引物和在ψJα的上游引物，只有形成DNA环，才能扩增到PCR产物。对于KREC，发生第二次删除后，在intronRSS位点和Kde位点的引物也只有在形成了KREC环后才能扩增出PCR产物。Douek等人应用竞争PCR(QC-PCR)检测外周血中的TREC。Zhang等团队应用实时PCR(Real-TimePCR)及分子天平进行检测。Harthi等应用PCR-ELISA的方法检测血中TREC的数量，并与Douek及Zhang应用的方法进行了比较，认为QC-PCR有放射性，可能危害检测者的健康；实时PCR费用昂贵，且需要分子天平这种特殊仪器，而目前大多数实验室均不具备这种检测条件。PCR-ELISA在扩增之后要进行ELISA反应，而ELISA是一个开放性的反应，很容易产生污染引起假阳性；且其操作繁琐，灵敏度和特异性都有待提高。Alessandra等人同时检测了TREC和KREC，但是基于荧光定量PCR，也存在上述的问题。目前国内外检测TREC和KREC普遍基于PCR+荧光探针定量的方法，通量较低。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高通量测量方法，用于解决PID判断通量低、判断准确性低的技术问题。为达成上述目的，本专利技术提出如下技术方案：一种高通量测量方法，利用引物获得TREC扩增产物和/或KREC扩增产物，构建测序文库进行高通量测试。进一步的，在本专利技术中，扩增TREC时，在α和δ基因簇上的signal-joint环断点为chr14:22386826-22386826和chr14:22475315-22475315；其中，上述α和δ基因簇的基因组版本为Hg38，坐标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量测量方法，其特征在于：利用引物获得TREC扩增产物和/或KREC扩增产物，构建测序文库进行高通量测试。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量测量方法，其特征在于：利用引物获得TREC扩增产物和/或KREC扩增产物，构建测序文库进行高通量测试。


2.根据权利要求1所述的高通量测量方法，其特征在于：扩增TREC时，在α和δ基因簇上的signal-joint环断点为chr14:22386826-22386826和chr14:22475315-22475315；其中，上述α和δ基因簇的基因组版本为Hg38，坐标分别为chr14:21621904-22552132和chr14:22422546-22466577，TREC的signal_joint环的长度是88489bp。


3.根据权利要求1所述的高通量测量方法，其特征在于：扩增KREC时，signal-joint环断点为chr2:88832772-88832772和chr2:88859608-88859608；其中，上述基因组版本为Hg38，坐标分别为chr14:21621904-22552132和chr14:22422546-22466577，KREC第二次删除产生的signal_joint环的长度是26836bp。


4.引物，用于权利要求2中的高通量测量方法，其特征在于：扩增TREC的引物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对用于扩增TREC的signal-joint环断点连接处，所述第二对引物对用于扩增TREC的coding-joint断点连接处；
扩增TREC的引物为以下两批之一：
第1批中，第一引物对包括
引物1：TCAACCATGCTGACACCTCT；
引物2：GTTTTCGGCCGTGATTCGTC；
第二引物对包括
引物1：TCCTCAAGGGTCGAGACTGT；
引物2：GTGTTGGCTCCAAATGTCAGT；
第2批中，第一引物对包括
引物1：CCCTCTCCAAGGCAAAATGG；
引物2：CACTCCCCAGGATGGAAAACA；
第二引物对包括
引物1：ATCCTCAAGGGTCGAGACTG；
引物2：TGGCTCCAAATGTCAGTTTCCTA。


5.引物，用于权利要求3中的高通量测量方法，其特征在于：扩增KREC的引物包括第三引物对和第四引物对，所述第三引物对用于扩增KREC的signal-joint环断点连接处，所述第四对引物用于扩增KREC的coding-joint断点连接处；
扩增KREC的引物为以下两批之一：
第1批中，第三引物对包括
引物1：CTTCTCCCTGGTTTTCCCAGC；
引物2：AGTTAAGGAGTAGGCAGGAGGA；
第四引物对包括
引物1：AGGCTTCCTAGGGAGGTCAG；
引物2：CCTGTGTCTGCCCGATTGAT；
第2批中，第三引物对包括
引物1：CCCAGCTCAGCGCCCATTACGTTT；
引物2：CCAGGAGCCAGCTCTTACCCTAGA；
第四引物对包括
引物1：AGGTTGTCCTAGGGAGCAGGGA；
引物2：TGCTGCCGTAGCCAGCTTTCC。


6.引物组合，其特征在于：包括上述权利要求4中的用于扩增TREC的引物和权利要求5中的用于扩增KREC的引物。


7.试剂盒，其特征在于：包括权利要求4或5中任意一种或多种引物。


8.一种样本结果的判断方法，其特征在于：分别利用权利要求4中的2批次引物获得TREC扩增产物和利用权利要求5中的2批次引物获得KREC扩增产物；其中
第1批TREC引物中，第一引物对和第二引物对获得的产物分别为TREC_sj_1序列、TREC_cj_1序列；
第1批KREC引物中，第三引物对和第四引物对获得的产物为KREC_sj_1序列、KREC_cj_1序列；
第2批TREC引物中，第一引物对和第二引物对获得的产物分别为TREC_sj_2序列、TREC_cj_2序列；
第2批KREC引物中，第三引物对和第四引物对获得的产物分别为KREC_sj_2序列、KREC_cj_2序列；
采用上述引物对目标样本扩增TREC的signal-joint环断点连接处、扩增TREC的coding-joint断点连接处、扩增KREC的signal-joint环断点连接处、扩增KREC的coding-joint断点连接处；
其中，目标样本的TRECsignaljoint校正覆盖度为Td_sj；目标样本的TRECcodingjoint校正覆盖度为Td_cj；目...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍远亮，杨锋，梁萌萌，姜玥，
申请(专利权)人：苏州赛福医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32