动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体及其应用制造技术

动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体及其应用，以木聚糖酶野生型GtXyn10的核苷酸序列SEQ ID NO.7为基础，选择突变位点R进行突变得木聚糖酶突变体：当突变位点R为G92C时，木聚糖酶突变体为GtXyn10‑G92C；当突变位点R为Q99S时，木聚糖酶突变体为GtXyn10‑Q99S；当突变位点R为G92C/Q99S时，木聚糖酶突变体为GtXyn10‑G92C/Q99S。该木聚糖酶突变体的最适pH值在3.5‑4.5之间，与野生型相比变化不大，但是在40℃条件下的比活力分别是野生型的1.8倍、1.7倍和2.4倍,尤其是突变体GtXyn10‑G92C/Q99S在40℃下的比活高达587U/mg，已经超过了大部分高温木聚糖酶。

【技术实现步骤摘要】
动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种动物体温(40℃)条件下高比活耐热木聚糖酶突变体及其应用。
技术介绍
植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中纤维素占30％–50％，半纤维素占20％–35％(WongKK1988,52:305–317.)。半纤维素一般指自然界植物细胞壁中除果胶和纤维素类成分之外的其他聚糖类物质，主要包括木聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。而木聚糖是半纤维素中含量最高的多糖，广泛存在于农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆和甘蔗渣等中，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一(PradeR1995,13(12):101–131.)。木聚糖的结构复杂，其主链是由吡喃木糖以β-D-1,4-木糖苷键连接，并带有多种取代基(Collinsetal.,2005)。木聚糖酶是木聚糖降解过程中最关键的一类酶，它能够降解木聚糖主链的β-1,4-糖苷键。目前，利用生物酶来降解木聚糖的相关研究受到很大重视(Yuanetal.,2004)，与化学法降解相比，利用生物酶降解木聚糖的方法有很多优点，比如酶解反应的作用条件较温和，消耗能量相对较低，对反应容器或设备要求低，催化效率高并且最主要的是对环境的污染很小。木聚糖酶在自然界中分布极广，其中微生物来源的木聚糖酶是目前实际应用和研究中最常用的材料。木聚糖酶主要分布在糖苷水解酶的第5、7、8、10、11、30和43家族，而这其中，对于第10，11家族的木聚糖酶改良报道最多，研究也相对透彻。第11家族木聚糖酶催化活力相对较高，但稳定性普遍较差；而第10家族木聚糖酶热稳定性较好，但催化效率较低，尤其是在动物体温(40℃)条件下的催化效率很低，几乎检测不到，使其难以应用于饲料工业。而在此前，木聚糖酶的热稳定性改造已经有许多成功的案例，比如Wang等人把二硫键引入到木聚糖酶的N末端和手指区域(Fingerdomain)之间，使酶的Tm值提高了8℃(WangQ，ZhaoLL，SunJY，2012，28(3):929–935)；Zhang等人将耐热性强的木聚糖酶的N端替换到其他中温木聚糖酶的N端，使酶的Tm值提高了34℃(ZhangH,LiJ,WangJ,etal.2014,7(1):3–13.)。对来源于自然生物资源的酶进行分子水平的改造才能获得性质优良的木聚糖酶，科学家主要通过参考组成蛋白质的氨基酸序列和真实结构或通过同源建模获得的模拟结构以及蛋白质的功能等信息，对自然界的酶采取理性、半理性或随机定向进化、突变、区段重组、构建杂合体以及活性位点突变技术等方法进行研究。在此之前，木聚糖酶的热稳定性改良研究已经报道了大量的研究成果，但至今却没有一个较为通用的方法或者普适性的理论，而且大部分成功案例中都会出现类似的问题，那就是酶的热稳定性和酶活力两者无法兼顾，即热稳定性提高的同时会伴随着酶活性的损失。
技术实现思路
解决的技术问题：针对上述技术问题，本专利技术提供一种动物体温(40℃)条件下高比活耐热木聚糖酶突变体及其应用，该突变体为木聚糖酶活性loop区上的氨基酸位点突变后得到的突变体。技术方案：一种动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体，以木聚糖酶野生型GtXyn10的核苷酸序列SEQIDNO.7为基础，选择突变位点R进行突变得木聚糖酶突变体：当突变位点R为G92C时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-G92C，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；当突变位点R为Q99S时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-Q99S，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；当突变位点R为G92C/Q99S时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-G92C/Q99S，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。编码木聚糖酶突变体GtXyn10-G92C的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；编码木聚糖酶突变体GtXyn10-Q99S的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；编码木聚糖酶突变体GtXyn10-G92C/Q99S的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。一种重组载体，含有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。一种重组菌株，含有上述的载体。上述动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体在制备饲料添加剂中的应用。上述动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体在降解木质纤维素上的应用。动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体的构建方法，包括以下步骤：1)采用over-lapPCR的方法扩增高催化效率木聚糖酶突变体序列片段；2)将木聚糖酶突变体序列片段克隆到表达载体pPIC9r的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，获得重组质粒；3)将突变体重组质粒转化毕赤酵母GS115感受态，诱导表达，获得突变菌株；4)培养突变菌株，诱导重组木聚糖酶表达；5)回收并纯化所表达的高比活木聚糖酶突变体。有益效果：本专利技术提供一种性质优良的、适合于动物体温(40℃)条件下催化木质纤维素的木聚糖酶突变体。该木聚糖酶突变体的最适pH值在3.5-4.5之间，与野生型相比变化不大，但是在40℃条件下的比活力分别是野生型的1.8倍、1.7倍和2.4倍。动物肠道体温环境在40℃左右，酶在40℃下的催化活力提高有利于该酶在动物消化道中更好的发挥降解功能；且90℃下的热稳定性均比野生酶有不同程度的提高，动物饲料制粒过程中有一段瞬时高温过程(80-90℃，10s)，酶在90℃下的热稳定性提高，有利于酶抵抗高温制粒过程，最后不至于失活；这样一种在酸性pH环境和动物体温条件下有较高酶活力且在高温条件下稳定的木聚糖酶被认为是饲料行业中性质优良的饲料添加用酶，有着非常广阔的应用前景。相对于通过盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段获得适用于工业生产的木聚糖酶，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间。这样一种在酸性pH环境和中低温范围内保持稳定并具有高酶活的木聚糖酶突变体可用于降解木质纤维素，生产还原糖，具有广阔的应用前景。附图说明图1为40℃下高比活木聚糖酶突变体与野生型的最适pH；图2为40℃下高比活木聚糖酶突变体与野生型的pH稳定性；图3为高比活木聚糖酶突变体与野生型的最适温度；图4为70℃下高比活木聚糖酶突变体与野生型的热稳定性；图5为80℃下高比活木聚糖酶突变体与野生型的热稳定性。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步描述。1、菌株及载体：表达宿主PichiapastorisGS115，表达质粒载体pPIC9r从Invitrogen公司购买；2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，大麦葡聚糖购自Sigma公司；其它都为国产分析纯试剂(均从国药集团购买)；3、培养基：(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH7.0；(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；(3)MD固本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体，其特征在于，以木聚糖酶野生型GtXyn10的核苷酸序列SEQ ID NO.7为基础，选择突变位点R进行突变得木聚糖酶突变体：当突变位点R为G92C时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-G92C，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；当突变位点R为Q99S时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-Q99S，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；当突变位点R为G92C/Q99S时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-G92C/Q99S，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体，其特征在于，以木聚糖酶野生型GtXyn10的核苷酸序列SEQIDNO.7为基础，选择突变位点R进行突变得木聚糖酶突变体：当突变位点R为G92C时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-G92C，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；当突变位点R为Q99S时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-Q99S，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；当突变位点R为G92C/Q99S时，木聚糖酶突变体为GtXyn10-G92C/Q99S，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.根据权利要求1所述动物体温下高比活耐热木聚糖酶突变体，其特征在于，编码木聚糖酶突变体GtX...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛研，游帅，谢晨，查子千，王俊，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32