一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9制造技术

本发明专利技术公开了一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9，该突变体MutG360Δ9具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其热活性和热稳定性发生了改变，在中温时活性更低且更不耐热，有利于通过温度变化控制酶的催化反应。野生酶InuAMN8在40℃和50℃时分别具有94％和40％的活性，突变酶MutG360Δ9在40℃和50℃时分别具有52％和12％的活性；50℃处理20min后，野生酶InuAMN8保留84％的活性，突变酶MutG360Δ9完全失活。本发明专利技术的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

【技术实现步骤摘要】
一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9
本专利技术涉及一种外切菊粉酶突变体，具体涉及一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9。
技术介绍
菊粉是一种由D-呋喃果糖经β-2,1-糖苷键连接，还原端经α-1,2-糖苷键连接一个葡萄糖残基构成的果聚糖，是一种来源丰富的可再生资源，主要产于菊芋、菊苣等多种菊科植物中。菊芋抗病能力强、根块产量高，属于非粮作物。外切菊粉酶可将菊粉降解，生成糖含量高达95％的果糖浆。果糖广泛用于食品、医药、生物能源等行业。因而，外切菊粉酶可应用于食品、酿酒和医药等行业中(SinghRSetal.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2017,96:312–322)。低温酶具有重要的开发价值，低温下的食品处理可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，清酒和葡萄酒的发酵、水产养殖环境、洗涤、污水处理通常在低温下进行；此外，低温处理还可降低能耗(Cavicchiolietal.MicrobialBiotechnology,2011,4(4):449–460)。对热越敏感的酶越容易变性，热变性又使酶容易被降解，该特性使酶的催化反应得以简易控制，同时使酶的使用更具安全性，在食品、酿酒和洗涤等行业中具有应用的价值。因此，获得不耐热的低温外切菊粉酶突变体，将有利于酶在食品、酿酒和洗涤等行业中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9，该突变酶MutG360Δ9在中温时活性更低且更不耐热，有利于通过温度变化控制酶的催化反应。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9，该突变体MutG360Δ9具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。与GenBank记录的外切菊粉酶序列AGC01505(SEQIDNO.3)相比，MutG360Δ9少了9个氨基酸，即少了AGC01505的第360位至368位的GHVRLGPQP这9个氨基酸。本专利技术的突变体MutG360Δ9的最适温度为35℃，在40℃和50℃时分别具有52％和12％的活性，温度从0℃上升到30℃，MutG360Δ9的活性从16％上升到89％；37℃处理60min后，MutG360Δ9保留42％的活性；50℃处理20min后，MutG360Δ9完全失活。本专利技术的另一目的是提供所述的突变体MutG360Δ9的编码基因mutG360Δ9。优选地，所述编码基因mutG360Δ9具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供包含所述的编码基因mutG360Δ9的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含所述的编码基因mutG360Δ9的重组菌。本专利技术的另一目的是提供所述的突变体MutG360Δ9的制备方法，该方法包含：将具有如SEQIDNO.4所示核苷酸序列的野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，以如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示核苷酸序列的突变引物，通过PCR扩增得到包含mutG360Δ9的重组表达质粒pEasy-E1-mutG360Δ9；将重组表达质粒pEasy-E1-mutG360Δ9转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutG360Δ9的重组菌株；培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutG360Δ9表达，以获得重组外切菊粉酶突变体MutG360Δ9。优选地，所述包含mutG360Δ9的重组菌株的制备为，将所述重组表达质粒pEasy-E1-mutG360Δ9经DpnI酶消化，利用MutIIFastMutagenesisKit试剂盒将消化产物进行连接，再通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。优选地，所述诱导采用IPTG进行诱导。优选地，所述重组外切菊粉酶突变体MutG360Δ9表达的产物经Nickel-NTAAgarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化，获得重组外切菊粉酶突变体MutG360Δ9。本专利技术的另一目的是提供所述的突变体MutG360Δ9在食品、酿酒及洗涤中的应用。本专利技术的不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9，具有以下优点：与野生酶InuAMN8相比，突变酶MutG360Δ9的热活性和热稳定性发生了改变，突变酶MutG360Δ9在中温时活性更低且更不耐热，有利于通过温度变化控制酶的催化反应。野生酶InuAMN8在40℃和50℃时分别具有94％和40％的活性，突变酶MutG360Δ9在40℃和50℃时分别具有52％和12％的活性；37℃处理60min后，野生酶InuAMN8保留88％的活性，突变酶MutG360Δ9保留42％的活性；50℃处理20min后，野生酶InuAMN8保留84％的活性，突变酶MutG360Δ9完全失活。本专利技术的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。附图说明图1为野生酶InuAMN8和突变酶MutG360Δ9的SDS-PAGE分析。图2为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutG360Δ9的热活性。图3为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutG360Δ9在37℃时的稳定性。图4为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutG360Δ9在50℃时的稳定性。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下实施例中的实验材料和试剂：1、菌株及载体大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E1可购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(Arthrobactersp.)由云南师范大学提供，保藏于云南省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为YMF4.00006。2、酶类及其它生化试剂Nickel-NTAAgarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及MutIIFastMutagenesisKit试剂盒购自南京诺维赞公司，菊粉购自AlfaAesar公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9，其特征在于，该突变体MutG360Δ9具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9，其特征在于，该突变体MutG360Δ9具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的突变体MutG360Δ9的编码基因mutG360Δ9。


3.根据权利要求2所述的编码基因mutG360Δ9，其特征在于，所述编码基因mutG360Δ9具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。


4.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutG360Δ9的重组载体。


5.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutG360Δ9的重组菌。


6.如权利要求1所述的突变体MutG360Δ9的制备方法，其特征在于，该方法包含：
将具有如SEQIDNO.4所示核苷酸序列的野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；
以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，以如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示核苷酸序列的突变引物，通过PCR扩增得到包含mutG360Δ9的重组表...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蕊，周峻沛，黄遵锡，岑潇龙，许波，韩楠玉，唐湘华，李俊俊，吴倩，高艳秀，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53