热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T及其应用，该菊粉酶突变体MutY119T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体MutY119T的氨基酸序列是将野生外切菊粉酶InuAMN8的第119位酪氨酸突变为苏氨酸获得的。与野生酶InuAMN8相比，本发明专利技术的突变酶MutY119T的低温活性提高，热稳定性降低，在氯化钠中的活性和稳定性降低，有利于酶的安全性使用和应用于低温环境要求下的生物技术领域。本发明专利技术的低温外切菊粉酶突变体MutY119T可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

【技术实现步骤摘要】
热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T及其应用
本专利技术涉及一种菊粉酶突变体，具体涉及一种热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T及其应用。
技术介绍
菊粉主要存在于菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和朝鲜蓟等植物体的根部或茎部，是一种来源丰富的可再生资源。菊芋价格低廉、产量高，更重要的是菊芋属于非粮作物，这些特点使菊芋的有效利用成为关注的焦点。菊粉经外切菊粉酶水解，可得到糖含量高达95％的果糖浆。果糖甜度是蔗糖的1.5～2.0倍，并且热量低、风味好，可作为天然甜味剂替代蔗糖；果糖代谢不受胰岛素的制约，可以供糖尿病患者食用；果糖经酵母等发酵后可以用来生产生物乙醇、2,3-丁二醇等。因而，外切菊粉酶可应用于食品、酿酒和生物能源等行业中(SinghRSetal.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2017,96:312～322)。低温酶在低温下具有高的催化活性，可应用于低温环境要求下的生物
，如清酒和葡萄酒的发酵温度一般<25℃，水产养殖环境、洗涤、污水处理通常在低温下进行。另外，低温下的处理(如果汁澄清)可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，将中温或者高温处理方式转为低温处理方式还可起到降低能耗的作用(Cavicchiolietal.MicrobialBiotechnology,2011,4(4):449～460)。因此，提高酶在低温下的催化活性将有利于酶在食品、酿酒和洗涤等行业中的应用。对热和盐越敏感的酶越容易变性，变性又使酶容易被降解，该特性使酶的催化反应得以简易控制，简单的热处理或者盐处理就可以使酶失活，操作简便又有效，同时使酶的使用更具安全性；热处理和盐处理还可以有效防止微生物的污染。因此，获得热和盐敏感的突变酶，将有利于酶在食品、酿酒和洗涤等行业中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T及其应用，该突变酶MutY119T的低温活性提高，热稳定性降低，在氯化钠中的活性和稳定性降低。为了达到上述目的，本专利技术提供了热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T，该菊粉酶突变体MutY119T的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。与GenBank记录的外切菊粉酶序列AGC01505(SEQIDNO.3)相比，MutY119T的第119位氨基酸为苏氨酸，而AGC01505的119位氨基酸为酪氨酸。本专利技术的突变体MutY119T的最适温度为30℃，在0℃、10℃、20℃和40℃时分别具有19％、41％、73％和56％的活性；50℃处理60min后，MutY119T剩余41％的酶活；在酶促反应体系中添加5.0～25.0％(w/v)的NaCl，MutY119T的活性从59％降到24％；经5.0～25.0％(w/v)的NaCl处理60min后，MutY119T的酶活从97％降到89％；MutY119T可水解菊粉产生果糖。本专利技术的另一目的是提供所述的菊粉酶突变体MutY119T的编码基因mutY119T。优选地，该编码基因mutY119T的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的另一目的是提供包含所述的编码基因mutY119T的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含所述的编码基因mutY119T的重组菌。本专利技术的另一目的是提供所述的菊粉酶突变体MutY119T的制备方法，该制备方法包含：(1)将野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；(2)以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，采用的引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，通过PCR扩增得到包含mutY119T的重组表达质粒pEasy-E1-mutY119T；(3)将重组表达质粒pEasy-E1-mutY119T转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutY119T的重组菌株；(4)培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutY119T表达；(5)回收并纯化所表达的重组外切菊粉酶突变体MutY119T。优选地，所述包含mutY119T的重组菌株的制备为，将所述重组表达质粒pEasy-E1-mutY119T经DpnI酶消化，利用MutIIFastMutagenesisKit试剂盒将消化产物进行连接，再通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。优选地，所述诱导采用IPTG进行诱导。优选地，所述包含mutY119T的重组菌株的表达产物经Nickel-NTAAgarose和0～500mM的咪唑分别亲和和纯化，获得重组外切菊粉酶突变体MutY119T。本专利技术的另一目的是提供所述的突变体MutY119T在食品、酿酒及洗涤中的应用。本专利技术的热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T及其应用，具有以下优点：与野生酶InuAMN8相比，本专利技术的突变酶MutY119T的低温活性得到提高，热稳定性降低，在氯化钠中的活性和稳定性降低。野生酶InuAMN8的最适温度为35℃，在0℃、10℃、20℃和40℃时分别具有15％、32％、58％和94％的活性；而本专利技术的突变酶MutY119T的最适温度为30℃，在0℃、10℃、20℃和40℃时分别具有19％、41％、73％和56％的活性；50℃处理60min后，野生酶InuAMN8剩余82％的酶活，突变酶MutY119T剩余41％的酶活；在酶促反应体系中添加5.0～25.0％(w/v)的NaCl，野生酶InuAMN8的活性从79％降到15％，突变酶MutY119T的活性从59％降到24％；经5.0～25.0％(w/v)的NaCl处理60min后，野生酶InuAMN8的酶活几乎没有损失，而本专利技术的突变酶MutY119T的酶活从97％降到89％。因此，本专利技术的低温外切菊粉酶突变体MutY119T可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。附图说明图1为野生酶InuAMN8和突变酶MutY119T的SDS-PAGE分析。图2为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutY119T的热活性。图3为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutY119T在50℃时的稳定性。图4为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutY119T在NaCl中的活性。图5为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutY119T在NaCl的稳定性。图6为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutY119T水解菊粉的产物分析。标号：图1中，M：蛋白质Marker；图6中，W：野生酶InuAMN8水解菊粉的产物；CK：对照组，含菊粉和失活的野生酶InuAMN8(煮沸10min)；F：果糖；G：葡萄糖；Mut：突变酶MutY119T水解菊粉的产物。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T，其特征在于，该菊粉酶突变体MutY119T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T，其特征在于，该菊粉酶突变体MutY119T的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所述的菊粉酶突变体MutY119T的编码基因mutY119T。


3.根据权利要求2所述的编码基因mutY119T，其特征在于，该编码基因mutY119T的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutY119T的重组载体。


5.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutY119T的重组菌。


6.如权利要求1所述的菊粉酶突变体MutY119T的制备方法，其特征在于，该制备方法包含：
(1)将野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；
(2)以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，采用的引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，通过PCR扩增得到包含mutY119T的重组表达质粒pEasy-E1-mu...

【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，张蕊，黄遵锡，岑潇龙，唐湘华，许波，李俊俊，韩楠玉，吴倩，高艳秀，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53