提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法技术

本发明专利技术涉及一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，该方法在第二次传代培养时使用细胞培养摇床进行摇动培养，所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°，第二次传代培养使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养器皿，能够进一步提高神经前体细胞的产量。使用所述的悬浮摇动培养方法对间充质干细胞(MSC)进行培养，可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

【技术实现步骤摘要】
提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法
本专利技术涉及细胞生物学
，特别涉及一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法。
技术介绍
中枢神经系统损伤或发育不良会引起神经细胞凋亡、神经组织缺损、运动及思维等能力缺陷，最终导致终身残疾甚至寿命缩短。中枢神经系统自我修复能力极低，治疗此类疾病需要使用细胞替代疗法，对凋亡缺损的神经细胞和组织进行补充，进而恢复神经系统的功能。神经前体细胞(Neuralprogenitorcells，NPC)在神经系统发育和神经损伤修复过程中起重要作用，成体神经损伤修复困难与NPC缺乏或沉默有关。既往的研究表明，移植同种异体NPC能缓解帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等疾病，能促进神经退行性疾病、外伤等轴突损伤髓鞘新生和修复，缓解临床症状，但NPC来源极为有限，限制了其临床应用。成体NPC的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内很难取材，而流产胎儿脑组织分离NPC又受到伦理学限制，样本资源成为限制NPC研究和应用的瓶颈。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞和多种成体干细胞有神经前体细胞分化潜能，为神经前体细胞制备提供了新的思路。间充质干细胞(Mesenchymalstemcell，MSC)是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。脂肪、脐带、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞能分化成Netstin阳性神经前体细胞，具有神经元、神经胶质细胞等的分化潜能。目前的研究发现，使用EGF、bFGF等细胞因子可以诱导MSCs向神经组织细胞分化。但如果要得到均一性高的Nestin+神经前体细胞则需要经过神经球培养阶段。神经球培养是将MSC接种至疏水培养容器中培养，形成多细胞聚集的细胞球，属于半悬浮培养体系，其培养容量小、操作复杂、难于传代扩增，导致细胞收率低，限制了基于神经前体细胞的神经组织修复医学的产业化转化。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，该方法在第二次传代培养时使用细胞培养摇床进行摇动培养，所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°，使用所述的悬浮摇动培养方法对间充质干细胞(MSC)进行培养，可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。本专利技术提供一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，包括如下步骤：(1)分离间充质干细胞，原代培养；(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养器皿表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养；(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养器皿表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养；(4)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞；所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。进一步的，所述细胞培养摇床的摇动频率为15次/分钟、摇动角度为15°。实验证明摇动频率15次/分钟、摇动角度15°的设置下神经前体细胞的产量最高。进一步的，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。来源于人类的间充质干细胞用于获得人神经前体细胞，可应用于人神经性疾病的治疗。进一步的，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。所述组织都是人体容易获取间充质干细胞的组织。进一步的，所述步骤(2)中第一次传代培养使用的所述细胞培养器皿经过“促进细胞贴壁”处理；所述步骤(3)中第二次传代培养使用的所述细胞培养器皿未经过“促进细胞贴壁”处理。第二次传代培养使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养器皿，能够进一步提高神经前体细胞的产量。本专利技术还提供所述的悬浮摇动培养方法在诱导神经前体细胞中的应用。综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：1.使用本专利技术的悬浮摇动培养方法获得的神经前体细胞的阳性率更高，产量更高。2.本专利技术的悬浮摇动培养方法具有较大的可扩展性，可以放大到培养面积更大的单一培养器皿，减少器皿总数同时提高产量，简化操作，降低成本。3.本专利技术的悬浮摇动培养方法得到的神经前体细胞可以用于治疗各类神经损伤性疾病。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例不同培养条件下神经前体细胞产量对比。图2为本专利技术的悬浮摇动培养方法的示意图。图3为表面处理和接种密度对神经前体细胞产量的影响。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。使用半悬浮培养体系，Nestin阳性的神经前体细胞比例较低，但本专利技术使用悬浮摇动培养方法，Nestin阳性神经前体细胞比例显著提升。Nestin是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性的表达在神经上皮干细胞上一种分子标记物，可能对神经元的分化有作用。Nestin仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止，一般被视为神经干细胞的特征性标志物。故使用悬浮摇动培养方法获得的神经前体细胞Nestin阳性率显著增加说明本专利技术的悬浮摇动培养方法通过改变培养方式，采用摇动频率10～20次/分钟、摇动角度10～20°，能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。常规细胞培养所使用的细胞培养器皿，往往经过“GasPlasma”等方法处理(例如Corning的)，促进细胞贴壁。细胞培养基质主要由聚苯乙烯制成，聚苯乙烯由碳氢分子组成，其表面主要由烷基组成，亲水性较低；而哺乳类动物细胞表面带电荷，亲水性高，故哺乳类动物细胞在未经处理的聚苯乙烯表面往往粘附力较低。聚苯乙烯表面经过气体等离子处理后，会产生大量的羟基(-OH)，亲水性显著提升，使哺乳类动物细胞更容易粘附生长。经促进细胞贴壁处理(Tc-Treated，简称TCT)和未经促进细胞贴壁处理(NonTc-Treated，简称nTCT)细胞培养基质如细胞培养皿和细胞培养板等，都以聚苯乙烯制成，最大分别是TCT基质表面经过气体等离子(GasPlasma)处理。细胞培养皿的聚苯乙烯基质是硬度较高的材料，会降低MSC向神经的分化，nTCT一定程度上减少了MSC贴壁，减少了MSC和聚苯乙烯的接触，释放了MSC的神经分化潜力，但静置培养下，MSC在经过一段时间后仍会有一定的贴壁。摇动培养则进一步防止MSC贴壁，使MSC达到完全悬浮培养，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)分离间充质干细胞，原代培养；/n(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养器皿表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养；/n(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养器皿表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养；/n(4)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞；/n所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分离间充质干细胞，原代培养；
(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养器皿表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养；
(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养器皿表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养；
(4)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞；
所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。


2.根据权利要求1所述的悬浮摇动培养方法，其特征在于，所述细胞培养摇床的摇动频率为15次/分...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐轶冰，施明耀，
申请(专利权)人：香港再生医学有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港;81