GMRA1,2,3化合物及其生物合成与应用制造技术

本发明专利技术构建了一株绛红色小单孢菌GMA102工程菌，通过基因工程技术，剔除

【技术实现步骤摘要】
GMRA1,2,3化合物及其生物合成与应用
本专利技术属生物合成制药领域，涉及氨醛糖类生物药物的研究开发与产业化及其关键技术的专利技术。
技术介绍
氨糖类药物已经在临床上应用了几十年，特别是在抗感染方面，临床应用将近80年，效果显著，经久不衰。庆大霉素是其中的典型代表。早期对庆大霉素的研究确认，具有抗菌，抗原虫和抗蠕虫等作用。最新研究发现，庆大霉素等氨糖类化合物还具有抗癌，抗遗传病和抗病毒等作用。因此，从氨糖类功能性化合物中发现新功能，特别是寻找新型氨糖化合物，是药物研究开发的重要途径之一，受到科学家的高度重视。特别是发现新型氨糖化合物，更是国际性难题，也是药物学家之殷殷期盼。通过代谢工程，研究各类药用微生物基因组上与药物合成有关的关键基因及其独特功能，来揭示不同化合物的生物合成途径与结构修饰，来提高药品质量，创造新型药物，并筛选新型功能性化合物，是当前药物研究开发的途径之一，也是热点之一，受到高层次科学家的青睐。产生氨糖类生理活性药物的药用微生物有链霉菌，小单孢菌等。它们都有一个共同特点，就是代谢产物丰富，除了主产物外，还能合成少量，甚至微量的其它活性产物。这其中最复杂的要算小单孢菌了。如产生庆大霉素的绛红色小单孢菌，产生西索霉素的伊纽小单孢菌，产福提霉素的橄榄星小单孢菌等。这给从小单孢菌代谢合成寻找新化合物埋下了伏笔。庆大霉素产生菌主要是小单孢菌，生物合成途径复杂，组分多种多样，有A，B，C等不同类别，研究最多的是C组分及其生物合成与基因组学。A，B组分以抗原虫为主，C组分以抗菌为主。不同组分有着不同的用途，堪称全身是宝。庆大霉素C族复合物，包括：C1a、C1、C2、C2a和C2b等，各个组分差异仅仅在甲基化的多少，以及甲基化的位点。不同位点的甲基化，以及甲基化的多少，影响着其关键的生理活性，甚至副作用。比如，庆大霉素C1a其抗菌活性比其它组分高，又是进一步开发半合成抗生素（依替米星）的母体，因此备受关注，所以，寻找含有新型结构特点的氨基寡糖，就显得非常有意义了。但是，由于糖类研究至今仍然是生命科学的难题。庆大霉素族代谢产物属氨糖类，因此，同样属国际性难题。基于氨糖化合物生物合成的多样性，潜含着可能具有巨大应用价值的生理活性物质。因此，几十年来，科学家一直在这一特殊领域，展开研究，期望得到新的化合物。特别是从代谢组学，基因组学，功能基因研究等方面入手，期望获得新化学实体，但收效甚微。随着对氨糖类化合物生理功能研究的深入，近十多年来，发现氨糖类化合物，不仅仅具有抗感染功能，还有抗癌，抗病毒，甚至治疗遗传病等潜在功效，因此，得到了科学家的高度重视，研究愈发得到关注。随着生命科学及其代谢工程技术的发展，对庆大霉素等生物合成基因的研究，不断取得新进展。随着对氨糖类生物合成基因功能研究的深入，对庆大霉素生物合成关键基因的认识越来越辩证。发现有些重要基因，潜伏着与理论预测不同，或者功能更多，且功能多样的奇妙特征，为发现新化合物增添了新的魅力。在借助生物学实验进行论证与阐明关键功能基因的过程中，构建了许多与产业化应用息息相关的新物种，解决了产业化中的关键技术难题，但还是很难发现新化合物。通过生物学实验，论证了gmrA基因的甲基化功能。有意义的是，该基因不仅仅只修饰核糖体上的甲基化，同时还与绛红糖胺3’,4’双脱羟基有关。此外，还与3”-N的醛基化有关联。本专利技术通过研究药用小单孢菌次级代谢产物生物合成基因的功能，来变换生物合成途径，寻找新化合物。理论推测，庆大霉素产生菌——绛红色小单孢菌，其生物合成基因簇上的gmrA基因，是对核糖体RNA进行甲基化修饰，来实现对氨基糖苷类抗生素的抗性。但通过生物学方法研究发现，该基因除了对核糖体甲基化修饰外，还影响庆大霉素加拉糖胺3”位N-的醛基化。通过灭活gmrA基因，阻断其对绛红糖胺3’,4’-位的脱羟基化，得到了系列新化合物：氨醛糖GMRA1,2,3.具有良好的抗菌，抗虫和抗病毒生理功能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株产氨醛糖GMRA1,2,3化合物的小单孢菌以及GMRA1，2，3化合物的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：制备满足基因工程接合转移所需的孢子。将保存于沙土管的庆大霉素产生菌G1008，接入斜面培养基，于37℃下，恒温培养，然后分离单菌落，进行复壮，得到生长丰满的斜面孢子。构建庆大霉素生物合成基因簇，借助生物信息学技术，推测相关功能基因的orf。通过生物学实验技术，验证各个orf的真实功能。借助分子生物学技术，敲除庆大霉素生物合成基因簇上的gmrA基因，验证gmrA基因功能。结果表明，gmrA基因确实具有甲基化作用，是耐药性基因的重要成员。除此之外，还极大地影响庆大霉素生物合成的代谢流。gmrA基因不仅仅修饰核糖体的甲基化，还修饰庆大霉素加拉糖胺3”-N的醛基化。因此，通过敲除gmrA基因，消除其功能，可以改变药用微生物的生物合成途径，得到新型化合物。这一推论预测与结果一致，最终得到了氨醛糖GMRA1,2,3化合物。这些化合物结构新颖，不仅具有庆大霉素C组结构的特点，又有庆大霉素A、B、X组结构的特征。但又与ABCX组的化学结构不同，属新型化合物，隐含着独特的药理学新功能。将该新型化合物称为氨醛糖组化合物。通过基因工程技术，敲除gmrA基因，构建gmrA基因缺失工程菌，获得新物种绛红色小单孢工程菌GMA102（绛红色小单孢菌变种GMA102，MicromonosporapurpureavariantGMA102）；将药用微生物细胞内的药物合成代谢流，定向引入新化合物氨醛糖GMRA1,2,3的生物合成。通过离子交换法，快速从工程菌的发酵液中提取、精制氨醛糖GMRA1,2,3新产品。
技术实现思路
主要包括以下几个步骤：A.复壮庆大霉素产生菌——绛红色小单孢菌G1008，得到生长丰满的斜面孢子；B.通过生物学实验技术，阐明庆大霉素生物合成基因簇上gmrA的功能，及其与药物生物合成的密切关系；C.构建敲除gmrA基因工程菌，得到绛红色小单孢菌变种GMA102，以及工程菌的鉴定；D.培养绛红色小单孢工程菌GMA102，经发酵得到含次级代谢产物的发酵液，通过发酵这一特殊过程，借助生物合成，得到氨醛糖GMRA1,2,3化合物；E.从发酵液中提取精制氨醛糖GMRA1,2,3化合物；F.氨醛糖化合物GMRA1,2,3化学结构的确定。G.氨醛糖化合物GMRA1,2,3抗菌，抗虫，看病毒（噬菌体）生理功能的初步确认。所述产氨醛糖GMRA1,2,3化合物的小单孢菌，所述小单孢菌命名为绛红色小单孢菌（Micromonosporapurpurea）GMA102，已于2021年1月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCCNO.21692，中国普通微生物菌种保藏管理中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述氨醛糖化合物GMRA1,2,3产自权利要求1所述小单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产GMRA1,2,3化合物的小单孢菌，其特征在于，所述小单孢菌命名为绛红色小单孢菌（

【技术特征摘要】
1.一株产GMRA1,2,3化合物的小单孢菌，其特征在于，所述小单孢菌命名为绛红色小单孢菌（Micromonosporapurpurea）GMA102，已于2021年1月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCCNO.21692。


2.一种如权利要求1所述小单孢菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）庆大霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪文荣，陈碧，陈跃，
申请(专利权)人：莆田学院，福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35