一种用于提高质粒发酵产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于提高质粒发酵产量的方法，所述方法包括：在以初级发酵培养基发酵一定时间后，通过补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵，以提高大肠杆菌质粒的产量。本发明专利技术的用于提高质粒发酵产量的方法通过优化补料培养基及补料方法，更快、更便捷地获得高质量、高产量的质粒DNA，实现大肠杆菌高密度培养，提高质粒产量，同时可保持质粒的完整性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高质粒发酵产量的方法
本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及一种用于提高质粒发酵产量的方法。
技术介绍
质粒DNA在基因工程、转基因生物、基因治疗、农业和DNA疫苗等方面起着关键性作用。近年来，随着生物制品的不断发展，质粒DNA正越来越多地应用于新的基因疗法，包括DNA疫苗、基因替代载体和用于病毒载体生产等。持续生产大量高纯度、高质量质粒DNA的能力也变得愈发重要。目前质粒DNA主要是大肠杆菌发酵，通过提取、层析(如阴离子交换、疏水相互作用)等一系列下游工艺来获得。其中菌种发酵在质粒DNA生产中占据主导地位。现有技术中，只能利用摇瓶培养用于毫克级质粒的生产，无法保证临床前和临床研究所用质粒的数量和质量的需求，导致无法实现工业化规模生产。目前，利用已有高产质粒的大肠杆菌，使用低温培养和维持低生长速率等方法，长时间培养后收获菌体，进行质粒的提取纯化，尽管产量较高，但其发酵周期过长，宿主蛋白等一些宿主菌自身产物的积累过多，这些都会影响终产品质粒DNA的质量。综上，现有的质粒DNA工艺生产中，仍面临质粒DNA产品质量品质不够好，以及工艺方法无法满足经济化和规模化的要求。因此有必要进行工艺方法的开发及优化。
技术实现思路
为此，本专利技术提一种用于提高质粒发酵产量的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供一种用于提高质粒发酵产量的方法，所述方法包括：在以初级发酵培养基发酵一定时间后，通过添加复合氮源的补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵，以提高大肠杆菌质粒的产量。本专利技术的一个实施例中，所述补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵包括先以某一比生长速率值进行指数补料发酵一定时间，再以低于所述某一比生长速率值进行指数补料发酵到结束。本专利技术的一个实施例中，所述方法还包括在所述指数补料发酵一定时间后，再以比生长速率值在0.08～0.15的区间线性变化，进行线性区间变化的指数补料发酵1～25h；在所述线性变化的指数补料过程中，若发酵液的OD600值与1小时前的OD600值比较，其OD600增量值小于2时，将所述补料培养基A替换为补料培养基B，再以4～6％发酵体积/h的补料速率进行补料发酵3～5h。本专利技术的一个实施例中，所述补料培养基B中，各组分含量为：葡萄糖150～250g/L、柠檬酸20～30g/L、甘氨酸4～8g/L、天冬氨酸2～6g/L、谷氨酰胺0.5～1.5g/L。本专利技术的一个实施例中，所述线性区间变化的指数补料发酵的开始时间为发酵的第8～9小时。本专利技术的一个实施例中，所述补料培养基A中，各组分含量为：酵母浸粉80～125g/L、葡萄糖150～250g/L、亮氨酸1.5～2.5g/L、脯氨酸1.5～2.5g/L、硫酸镁1.5～2.5g/L、硅酮消泡剂母液0.1～0.3mL/L。本专利技术的一个实施例中，所述初级培养基中各组分为：酵母浸粉24g/L、大豆蛋白胨12g/L、脯氨酸0.1g/L、亮氨酸0.1g/L、硅酮消泡剂母液50μL/L。本专利技术的一个实施例中，所述指数补料发酵的开始时间为发酵的第3～5小时，发酵维持时间为3-5小时，所述指数补料发酵的温度为37℃。本专利技术的一个实施例中，所述大肠杆菌质粒为pLP1-MDK质粒或pLP2-RSK质粒。本专利技术的一个实施例中，所述以初级发酵培养基发酵开始，菌种的接种量为10％。本专利技术中，比生长速率：每小时单位质量的菌体所增加的菌体量。μ＝ln2/t，μ即菌体增加一倍时的比生长速率，t为菌体增加一倍所用时间。本专利技术中，指数补料发酵：Ft葡萄糖补料速率(g/h)，μ比生长速率(h-1)，YX/S每克葡萄糖转换为细胞干重的效率(g/g)，Δs葡萄糖浓度(g/L)，X0细胞干重(g/L)，V0补料前培养体积(L)，e常数，t补料进行时间(h)。本专利技术的实施例中，是通过对补料时间和补料量的控制，以限定指数补料发酵过程中的比生长速率。本专利技术具有如下优点：本专利技术的用于提高质粒发酵产量的方法通过优化补料培养基及补料方法，能更快、更便捷地获得高质量、高产量的质粒DNA，实现大肠杆菌高密度培养，提高质粒产量，同时保持质粒的完整性。本专利技术的方法是基于对大肠杆菌生理生化特性，设计适用大肠杆菌稳定生长的富含氨基酸和复合氮源的补料培养基A液，又结合DNA复制中所需核苷酸的合成过程，增加了富含核苷酸合成前体所需氨基酸的补料培养基B，通过采用限制生长速率的补料方式，既限制了菌种在快速生长时代谢副产物的积累，又给予质粒充足的复制时间，保持菌种及质粒呈平稳状态增长。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
得能涵盖的范围内。图1A为本专利技术实施例1的分批补料发酵培养对pLP1-MDK质粒发酵结果；图1B为本专利技术实施例1采用分批发酵培养对pLP1-MDK质粒发酵结果；图2为本专利技术实施例2不同比生长速率对菌种生长及质粒产量的影响；图3A为本专利技术的pLP1-MDK质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，M为Maker，1、2、3、4、5、6分别代表不同浓度的质粒样品，以保证灰度值分析结果的准确性；其中1、2为100ng/μL，3、4为50ng/μL，5、6为25ng/μL。图3B为本专利技术的pLP2-RSK质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，M为Maker，1、2、3、4、5、6分别代表不同浓度的质粒样品，以保证灰度值分析结果的准确性；其中1、2为100ng/μL，3、4为50ng/μL，5、6为25ng/μL。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术中，发酵罐为迪必尔生物工程有限公司的5L玻璃发酵罐T&J-Btype5Lx2；本专利技术中，采用的发酵质粒为pLP1-MDK质粒，该使用的质粒是在pLP1(Invitrogen)基础上进行抗性基因改为卡那霉素抗性基因的pLP1-MDK质粒。本专利技术中，采用的发酵为质粒pLP2(Invitrogen)基础上抗性基因改为卡那霉素抗性基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，/n所述方法包括：在以初级发酵培养基发酵一定时间后，通过添加复合氮源的补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵，以提高大肠杆菌质粒的产量。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，
所述方法包括：在以初级发酵培养基发酵一定时间后，通过添加复合氮源的补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵，以提高大肠杆菌质粒的产量。


2.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，
所述补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵包括先以某一比生长速率值进行指数补料发酵一定时间，再以低于所述某一比生长速率值进行指数补料发酵到结束。


3.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，
所述方法还包括在所述指数补料发酵一定时间后，再以比生长速率值在0.08～0.15的区间线性变化，进行线性区间变化的指数补料发酵1～25h；
在所述线性变化的指数补料过程中，若发酵液的OD600值与1小时前的OD600值比较，其OD600增量值小于2时，将所述补料培养基A替换为补料培养基B，再以4～6％发酵体积/h的补料速率进行补料发酵3～5h。


4.如权利要求3所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，
所述补料培养基B中，各组分含量为：葡萄糖150～250g/L、柠檬酸20～30g/L、甘氨酸4～8g/L、天冬氨酸2～6g/L、谷氨酰胺0.5～1.5g/L。


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【专利技术属性】
技术研发人员：齐菲菲，鲁薪安，何霆，赵亮，王洲，
申请(专利权)人：北京艺妙神州医药科技有限公司，北京艺妙医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11