一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备及其应用。基于重组蛋白EbSWP1制得的单克隆抗体对于检测毕氏肠微孢子虫具有良好的特异性，不与虾肝肠微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、大肠杆菌等发生反应。本发明专利技术制备的单克隆抗体可与荧光素标记物偶联制得免疫荧光抗体，利用该抗体与环境、粪便中的毕氏肠微孢子虫做直接免疫荧光反应，可以快速、灵敏、准确地检验毕氏肠微孢子虫。与实验室最常用的PCR检测方法相比，本发明专利技术的免疫荧光检测方法操作简便，耗费时间短，且检测准确度高，以PCR结果为参考，本发明专利技术检测方法的准确率高于85％，该方法简便、快速、灵敏、准确的特点使其适用于基层检测应用。

【技术实现步骤摘要】
一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备及其应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体及其在毕氏肠微孢子虫检测中的应用。
技术介绍
微孢子虫(Microsporidia)是真核细胞内专性寄生的机会性单细胞病原体，能感染多种哺乳动物及鸟类，严重危害公共卫生安全。在所有微孢子虫虫种中，毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)是人患微孢子虫病中最常见的虫种，其易感人群包括艾滋病人、器官移植患者、癌症病人，甚至还包括健康的小孩和老人，能够导致免疫缺陷或低下者长期致死性腹泻，也能够导致免疫功能正常者剧烈的自限性腹泻。由于微孢子虫的尺寸很小，临床快速诊断微孢子虫感染仍存在困难。目前，实验室常用的微孢子虫诊断方法有PCR法、常规染色法和电子显微镜法。然而，这些方法主要用于研究型实验室和一些政府公共卫生实验室的毕氏肠微孢子虫检测，很少应用于临床诊断实验室。基于PCR的检测方法准确度高，且具有进一步鉴定虫种和基因型的突出优势，但PCR检测耗费的时间和成本较高。常规的染色法：KMnO4-甲基紫法、抗酸的三色染色法、荧光染色剂CalcofluorM2R染色法及Chromotrope2R染色法等，这些方法操作较PCR法更为简单，但特异性很低，且不能将微孢子虫鉴定到种。电子显微镜又分为扫描电子显微镜和透射电子显微镜，是一种极为准确的鉴定方法，由于它能够使得实验者观察到极丝和其它具有物种特性的超微结构，因此被认为是微孢子虫虫种鉴定的金标准，通常被用于虫体入侵、细胞定位等研究，但电子显微镜的操作繁琐、费用高、耗时长，设备昂贵以及需要更为专业的操作人员，也不适用于常规检测。免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项标记免疫技术，该技术具有操作便捷，图像直观，结果便于评价等优点，常用于临床检测，而提供一种特异性好、灵敏度高的检测抗体是该方法能否适用于基层检测毕氏肠微孢子虫的关键。虽然现有技术中也有一些免疫检测试剂盒，例如美国Waterborne公司的Bienusi-GloTM试剂盒可通过直接荧光免疫检测毕氏肠微孢子虫，其所使用的抗体源于孢子虫孢壁外的抗原决定簇，但其特异性不强，会出现非特异性染色，且价格昂贵，因此需要提供特异性更强的毕氏肠微孢子虫免疫检测方法。中国专利CN103728458A公开了兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1在制备诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染试剂中的应用，但目前还未见有关于毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白，及其用于毕氏肠微孢子虫检测中的相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为克服上述现有毕氏肠微孢子虫检测方法在基层检测应用中的不便，提供一种可快速准确的检测毕氏肠微孢子虫的抗体和方法。本专利技术的第一个目的是提供一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1。本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述孢壁蛋白SWP1的基因。本专利技术的第三个目的是提供一种重组表达载体。本专利技术的第四个目的是提供一种重组表达菌株。本专利技术的第五个目的是提供一种重组蛋白。本专利技术的第六个目的是提供一种单克隆抗体。本专利技术的第七个目的是提供一种免疫荧光抗体。本专利技术的第八个目的是提供所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述重组表达菌株、所述重组蛋白、所述单克隆抗体、所述免疫荧光抗体在制备诊断或检测毕氏肠微孢子虫感染试剂或试剂盒中的应用。本专利技术第九个目的是提供一种诊断或检测毕氏肠微孢子虫感染的试剂盒。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白基因EbSWP1，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种含有上述基因的重组表达载体。本专利技术还提供了一种含有上述重组表达载体的重组表达菌株。本专利技术还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白由所述重组表达载体或重组表达菌株经诱导表达后获得。本专利技术还提供了一种单克隆抗体，该抗体以所述重组蛋白为免疫原制备得到。本专利技术还提供了一种免疫荧光抗体，该免疫荧光抗体由所述单克隆抗体偶联荧光素标记物得到。另外，本专利技术还提供了一种诊断或检测毕氏肠微孢子虫感染的试剂盒，含有上述单克隆抗体或免疫荧光抗体。优选地，所述重组表达菌株为大肠杆菌。优选地，所述荧光素标记物为异硫氰基荧光素(FITC，激发光下显绿色)。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1、其编码基因及重组蛋白EbSWP1，利用重组蛋白EbSWP1制备的毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的特异性良好，不与虾肝肠微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、大肠杆菌等发生反应。所述单克隆抗体可与荧光素标记物偶联制得免疫荧光抗体。利用该抗体与环境、粪便中的毕氏肠微孢子虫做直接免疫荧光反应，可以快速、灵敏、准确地检验毕氏肠微孢子虫感染。利用本专利技术所述免疫荧光抗体检测毕氏肠微孢子虫感染，完成全部操作仅需2个小时，时间远少于实验室最常用的PCR检测方法，且准确率高，该抗体用于牛粪便样品检验时，以PCR结果为参考，其准确率大于85％，其简便、快速、灵敏、准确的特点使其可适用于基层检测毕氏肠微孢子虫感染。附图说明图1为重组蛋白检测结果图。图2为利用偶联了FITC的毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体荧光免疫检测毕氏肠微孢子虫的镜检结果示意图。图3为Bienusi-GloTM(现有的国外商品化试剂)染色结果。图4为荧光染色剂CalcofluorM2R染色结果。图5为Chromotrope2R染色结果(需要专业人员辨认镜检结果)。图6为直接免疫荧光与非特异微生物的直接免疫荧光反应结果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1毕氏肠微孢子虫的孢壁蛋白SWP1重组蛋白的制备1、孢壁蛋白SWP1基因的克隆转化及蛋白诱导表达专利技术人前期发现了一种毕氏肠微孢子虫的孢壁蛋白SWP1，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码基因EbSWP1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。利用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1的基因EbSWP1全长，所用引物由生工生物有限公司(中国上海)合成，其序列为：SWP1-F5'-CGGGATCCTATCAAGAAACAAAAAGATATATTG-3'(下划线标为BamHI限制酶位点)；SWP1-R5'-TTGTCGACATTAAATTTTTCAAGATGGTTTC-3'(下划线为SalI限制酶位点)；反应体系如表1所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白基因EbSWP1，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种重组表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述基因的核苷酸序列。


4.一种重组表达菌株，其特征在于，所述表达菌株含有权利要求3所述重组表达载体。


5.根据权利要求4所述的重组表达菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。


6.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白由权利要求4或5所述重组表达菌株经诱导表达后...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯耀宇，蒙西南，肖立华，李娜，郭亚琼，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44