一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法，包括以下步骤：1)挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.1‑1.1％氯化铁溶液，置于培养箱内培养48h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15m in；2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；3)将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；4)将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；5)利用Image‑ProPlus6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％作为血栓发生程度的指标；本发明专利技术的有益效果是试剂便宜，成模率稳定，成膜效果好。

【技术实现步骤摘要】
一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法
本专利技术属于医药领域，具体涉及一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法。
技术介绍
血栓形成是由遗传和环境多重因素引起，可发生于动脉和静脉内，静脉血栓多为红血栓会引起肢体肿胀、疼痛，静脉血栓脱落可进入肺循环，引起肺动脉栓塞，严重者会有呼吸困难，甚至死亡，动脉血栓多为白血栓，会引起肢体和重要脏器的缺血改变，动脉血栓脱落可以顺血流堵塞于远端动脉，引起肢体或器官坏死，血栓对人体的危害较大，需要积极治疗，目前，因为社会压力大、环境污染严重、不良生活方式等原因，血栓形成的年轻化趋势日益加剧。斑马鱼胚胎透明，体外发育，是研究血管性疾病的良好模型。目前，斑马鱼血栓模型研究的较少，可选择的方法不多，本专利技术的目的是提供一种新的斑马鱼血栓模型制备方法。
技术实现思路
经过氯化铁处理后，血管内皮细胞上会聚集许多高铁离子形成的聚集物，这些聚集物会附着血小板，从而形成血栓。本专利技术的制备过程如下：1.挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.1-1.1％氯化铁溶液，置于培养箱内培养48h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；2.移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；3.将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；4.将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；5.利用Image-ProPlus6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％值作为血栓发生程度的指标；其中，斑马鱼培养用水配方：5mmol/LNaCl，0.17mmol/LKCl，0.4mmol/LCaCl2，0.16mmol/LMgSO4；其中，邻联茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL邻联茴香胺，0.01mol/L醋酸钠，0.65％H2O2，0.16mmol/LMgSO4。优选的，本专利技术动物模型的制备方法，包括以下步骤：1.挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.7％氯化铁溶液，置于培养箱内培养48h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；2.移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；3.将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；4.将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；5.利用Image-ProPlus6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％值作为血栓发生程度的指标；其中，斑马鱼培养用水配方：5mmol/LNaCl，0.17mmol/LKCl，0.4mmol/LCaCl2，0.16mmol/LMgSO4；其中，邻联茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL邻联茴香胺，0.01mol/L醋酸钠，0.65％H2O2，0.16mmol/LMgSO4。本专利技术的另一个目的在于提供斑马鱼血栓动物模型的使用方法：1.根据以上内容制备斑马鱼血栓动物模型；2.加入待测药物，继续培养相应时间；3.用邻联茴香胺染色液染色15min；4.利用Image-ProPlus6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％值作为评价药物对血栓的影响的指标。本专利技术的有益效果是：获得了一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法，本专利技术具有试剂便宜，成模率稳定，成膜效果好的优点。附图说明图1：尾部血栓，A:对照组B:0.7％FeCl3溶液组图2：尾部血栓面积与躯干面积比图3：斑马鱼死亡率具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本专利技术，并不限制本专利技术的范围。实施例1：本专利技术动物模型的制备实验材料：DMSO、邻联茴香胺购自SIGMA公司；FeCl3、NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、醋酸钠、H2O2购自上海吉至生化科技有限公司；6孔板购自北京绿百草科技发展有限公司。实验仪器：莱卡DVM6体式显微镜购自北京瑞科中仪科技有限公司；恒温培养箱JF-JGDW20-100购自上海京孚仪器有限公司。斑马鱼饲养环境：实验用斑马鱼为AB系，参照Westefield的养殖方法，饲养于小鱼亲测科技(广州)有限公司，水温28℃，电导率400-810μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期为14h/10h。实验方法：挑选健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄2:1的比例放入鱼缸中，次日清晨获得胚胎，挑选健康优质的胚胎，放入28℃培养箱，每日换水两次，在斑马鱼发育至2dpf时，空白对照组、模型对照组各挑选发育正常的斑马鱼30条，空白对照组为胚胎培养水，模型对照组加入用胚胎培养水配制的质量分数分别为0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1.1％的FeCl3溶液继续培养48h，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；将斑马鱼置于新的6微孔板中加入等体积DMSO；取斑马鱼置载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；利用Image-ProPlus6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％值作为血栓发生程度的指标，结果见图1、图2，实验结束时各组胚胎死亡率见图3。由图1、图2可以看出，FeCl3溶液能够使斑马鱼形成血栓，0.7％与0.9％和1.1％组(血栓染色面积/躯干面积)×100％相差不大，但斑马鱼致死率大幅升高，因此0.7％为最佳剂量。实施例2本模型与苯肼诱导模型比较实验材料：DMSO、邻联茴香胺购自SIGMA公司；FeCl3、NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、醋酸钠、H2O2购自上海吉至生化科技有限公司；6孔板购自北京绿百草科技发展有限公司；苯肼购自成都点纯科技有限公司，苯肼用100％乙醇配成1.5mmol/L母液。实验仪器：莱卡DVM6体式显微镜购自北京瑞科中仪科技有限公司；恒温培养箱JF-JGDW20-100购自上海京孚仪器有限公司。斑马鱼饲养环境：实验用斑马鱼为AB系，参照Westefield的养殖方法，饲养于小鱼亲测科技(广州)有限公司，水温28℃，电导率400-810μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期为14h/10h。实验方法：挑选健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄2:1的比例放入鱼缸中，次日清晨获得胚胎，挑选健康优质的胚胎，放入28℃培养箱，每日换水两次，在斑马鱼发育至2dpf时，空白对照组、氯化铁模型组、苯肼模型组各挑选发育正常的斑马鱼30条，空白对照组为胚胎培养水、氯化铁模型组质量分数为0.7％，苯肼模型组浓度为1.5μmol/L，继续培养48h，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；将斑马鱼置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.1-1.1％氯化铁溶液，置于培养箱内培养48h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；/n2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；/n3)将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；/n4)将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；/n5)利用Image-Pro Plus 6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％作为血栓发生程度的指标；/n其中，斑马鱼培养用水配方：5mmol/L NaCl，0.17mmol/L KCl，0.4mmol/L CaCl

【技术特征摘要】
1.一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.1-1.1％氯化铁溶液，置于培养箱内培养48h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；
2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；
3)将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；
4)将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；
5)利用Image-ProPlus6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％作为血栓发生程度的指标；
其中，斑马鱼培养用水配方：5mmol/LNaCl，0.17mmol/LKCl，0.4mmol/LCaCl2，0.16mmol/LMgSO4；
其中，邻联茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL邻联茴香胺，0.01mol/L醋酸钠，0.65％H2O2，0.16mmol/LMgSO4。


2.一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.7％氯化铁溶液，置于培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶繁全，
申请(专利权)人：叶繁全，
类型：发明
国别省市：广东;44