同时检测HBA1/2和HBB基因位点多种突变的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种同时检测HBA1/2和HBB基因位点多种突变的引物组、试剂盒和方法。其中所述试剂盒包括以下试剂：（1）用于多重PCR扩增的试剂；和（2）用于构建三代测序文库的试剂。其中所述方法包括以下步骤：（1）制备受试者样本；（2）多重PCR同时扩增所述样本中HBA1/2和HBB基因片段；（3）构建三代测序文库；（4）测序并分析HBA1/2和HBB基因突变类型。HBA1/2和HBB基因突变类型。

【技术实现步骤摘要】
同时检测HBA1/2和HBB基因位点多种突变的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种利用三代长读长测序平台同时检测HBA1/2和HBB基因多种突变的引物组合和方法，以及适用于此方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]血红蛋白（Hemoglobin，简称Hb）是红细胞内运输氧的特殊蛋白质。成年人血红蛋白(Adult Hemoglobin，简称HbA)是由两对α
‑
珠蛋白和两对β
‑
珠蛋白组成的四聚体。α
‑
珠蛋白或β
‑
珠蛋白的合成缺失或不足会导致珠蛋白生成障碍性贫血，又称地中海贫血。由α
‑
珠蛋白基因突变引起的α珠蛋白缺失或不足称为α
‑
地中海贫血（简称α
‑
地贫）；由β
‑
珠蛋白基因突变引起的β珠蛋白缺失或不足称为β
‑
地中海贫血（简称β
‑
地贫）。地贫是世界上最常见的单基因遗传病，属常染色体隐性遗传，高发地区包括中国南方、东南亚、地中海地区、印度、中东和非洲等地区
[1,2]。
[0003]人源α
‑
珠蛋白（alpha
‑
globin）基因簇位于16号染色体，共包含7个基因位点：5
’‑
zeta
‑
pseudozeta
‑
mu
‑
psedudoalpha
‑1‑
alpha
‑2‑/>alpha
‑1‑
theta
‑3’
。其中只有HBA1 (alpha
‑
1)和HBA2 (alpha
‑
2)两个基因在胚胎和成年人中具有编码珠蛋白的能力，其他均为假基因或预测基因，或只在胚胎发育早期翻译表达珠蛋白。HBA1和HBA2基因的突变包括缺失型突变和非缺失型突变。我国最常见的缺失型HBA1和HBA2基因的突变为
‑
α3.7，
‑
α4.2，和
‑‑
SEA，非缺失型突变为HBA2: c.369C>G，HBA2: c.377T>C，HBA2: c.427T>C。这六种基因突变占中国人群α
‑
地贫总数的98%，因此现有的临床常规分子诊断主要针对上述突变
[3,4]。随着α
‑
地贫致病机制的不断阐明，越来越多的突变类型被发现。综合Ithanet、HbVar、LOVD和LOVD
‑
China地贫数据库，目前在世界范围已经发现约50种α
‑
珠蛋白基因簇区域的缺失，和超过900种HBA1和HBA2基因的非缺失型突变可导致α
‑
珠蛋白表达的减低或缺失。迄今为止在中国人群中发现了104种α
‑
珠蛋白基因突变，其中包括28种缺失型突变和76种非缺失型突变
[5]。除此之外还有些罕见的结构变异，如3.7三联体型αααanti3.7，4.2三联体型αααanti4.2，HKαα和antiHKαα等。HKαα的产生是由于
‑
α3.7缺失和αααanti4.2重组导致，而antiHKαα的产生是由于
‑
α4.2缺失和αααanti3.7重组导致。传统的Gap
‑
PCR方法无法区分HKαα和
‑
α3.7，也无法区分antiHKαα和
‑
α4.2，在筛选时会导致误诊
[9]。而准确区分这些基因型需要借助不同的PCR体系，无法在同一体系内实现同时检测。这些说明α
‑
地贫有较广的基因突变谱，增加目前α
‑
地贫基因缺陷的筛查范围，将会有效避免异常基因型的漏检。
[0004]人源β
‑
珠蛋白（beta
‑
globin）基因簇位于11号染色体，共包含5个基因位点：5
’‑
epsilon
‑
gamma
‑
G
‑
gamma
‑
A
‑
delta
‑
beta
‑3’
。其中只有HBB（beta）基因在成年人中编码珠蛋白，其他四个基因均在胚胎发育过程中表达，或者在成年人中表达量非常低。导致β
‑
地贫的遗传变异主要为HBB基因的点突变或小片段缺失，少数为大片段缺失
[6,7]。综合Ithanet、HbVar、LOVD和LOVD
‑
China地贫数据库，目前在世界范围已经发现超过1000种HBB基因的非缺失型突变。迄今为止在中国人群中发现了129种β
‑
珠蛋白基因非缺失型突变，但目前主要检测的主要是已知常见的17个位点19种突变，包括c.
‑
82C>A、c.
‑
80T>C、c.
‑
79A>G、c.
‑
78A>
G、c.
‑
78A>C、c.
‑
11_
‑
8delAAAC、c.79G>A、c.92+1G>T、c.92+5G>C、c.316
‑
197C>T、c.2T>G、c.45_46insG、c.84_85insG、c.52A>T、c.94delC、c.126_129delCTTT、c.130G>T、c.216_217insA、c.216_217insT
[8]。目前缺乏可行的方法实现一次性检测所有的HBB基因突变。
[0005]目前检测HBA1/2基因缺失型突变的试剂盒大多基于多重Gap
‑
PCR的方法，如亚能生物技术（深圳）有限公司、深圳益生堂生物科技有限公司和广州达安基因各自开发的α
‑
地中海贫血检测试剂盒，这些产品均只能实现3~4种常见的缺失型地贫突变（
‑
α3.7、
‑
α4.2、
‑‑
SEA和
‑‑
THAI）。目前诊断非缺失型α
‑
和β
‑
地中海贫血检测试剂盒均是基于PCR
‑
RDB法，主要检测常见的3个HBA2和17个HBB基因突变位点。这些检测试剂盒主要有以下几个方面局限：1、无法实现在同一体系内同时检测缺失型和非缺失型α
‑
和β
‑
地中海贫血相关突变检测；2、只检测常见的地贫突变，覆盖范围有限，容易造成漏检，比如罕见的HBA1/2和HBB基因点突变，以及αααanti3.7和ααant本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同时扩增HBA1/2和HBB基因突变的引物组，所述引物组包含如下的一个或多个引物：四条HBA正向引物HBA
‑
F1、HBA
‑
F2、HBA
‑
F3、HBA
‑
F4；两条HBA反向引物HBA
‑
R1、HBA
‑
R2；和HBB引物HBB
‑
F、HBB
‑
R；其中，所述的HBA
‑
F1引物位于基因组hg38 chr16: 165401
‑
169817之间；所述的HBA
‑
F2引物位于基因组hg38 chr16: 163801
‑
165400之间；所述的HBA
‑
F3引物位于基因组hg38 chr16：158801
‑
163800之间；所述的HBA
‑
F4引物位于基因组hg38 chr16:149801的上游；所述的HBA
‑
R1引物位于基因组hg38 chr16: 178388
‑
186641之间；所述的HBA
‑
R2引物位于基因组hg38 chr16:184801的下游；以及所述的HBB
‑
F和HBB
‑
R引物分别位于基因组hg38 chr11:5224302
‑
5228938上下游。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组可同时检测HBA1/2和HBB基因位点上多种突变，所述突变至少包括：如表9和表10所示的HBA1/2基因位点上903种点突变和33种结构变异，其中结构变异包括
‑‑
SEA、
‑
α3.7、
‑
α4.2、
‑‑
THAI、
‑‑
FIL、αααanti3.7、αααanti4.2、HKαα、antiHKαα、
‑‑
MED
‑
I、
‑‑
MED
‑
II、
‑
α6.3、
‑
α5.6、
‑‑
11.1、
‑
α
MAL3.5
、
‑
α3.8、
‑
α2.7、
‑
α2.4、
‑
α2.8、
‑
α1.2、
‑
α0.8、
‑
9.7、Qinzhou type deletion、
‑‑
BRIT、
‑
α3.5、
‑‑
SA、
‑
α20.5、
‑‑
NOR、
‑‑
CANT、
‑‑
SPAN、
‑‑
GEO、5.3kb deletion和
‑
α5.2；以及如表11所示的HBB基因位点上1135种点突变和2种结构变异，其中结构变异包括3.5 kb deletion和Taiwanese。3.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物HBA
‑
F1、HBA
‑
F2、HBA
‑
F3、HBA
‑
F4、HBA
‑
R1、HBA
‑
R2、HBB
‑
F和HBB
‑
R的序列分别如SEQ ID NO: 1
‑
8所示。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的引物组，其中所述的四条HBA正向引物HBA
‑
F1、HBA
‑
F2、HBA
‑
F3和HBA
‑
F4，以及两条HBA反向引物HBA
‑
R1和HBA
‑
R2，通过不同的组合检测不同的HBA1/2基因突变类型。5.根据权利要求1
‑
3任一项所述的引物组，其中所述引物在5
’
端加上5
‑
50nt不同序列的DNA，即DNA条形码，用于区分不同样本。6.根据权利要求1
‑
3任一项所述的引物组，其中所述引物组用于多重PCR扩增HBA1/2和HBB基因片段。7.根据权利要求1
‑
3任一项所述的引物组，其中所述引物组可用于检测HBA1/2和HBB基因的不同突变是否连锁。8.一种可同时检测HBA1/2和HBB基因的多种突变的试剂盒，包括以下试剂：1）用于多重PCR扩增HBA1/2和HBB基因片段的试剂；和2）用于构建三代测序文库的试剂。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述用于多重PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、反应缓冲液和引物组。10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述引物组为权利要求1
‑
7中任一项所述的引物组。11.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于同时检测HBA1/2和HBB基因的
突变或常见HBA1/2和HBB基因的不同突变是否连锁。12.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述用于构建三代测序文库的试剂包括接...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛爱平，张晓杰，张文琦，张建光，
申请(专利权)人：北京贝瑞和康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：