一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，其中菲和芘联合有氧降解的共生菌群使用四种菌株，分别为假单胞菌属(Pseudomonas.sp,GenBank:GCA_000006765.1)、芽孢杆菌属(Bacillus.sp,GenBank:AY881640.1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp,GenBank:AB000106.1)、无色杆菌属(achromobacter.sp,GenBank:GCA_004296055.1)，其中构建方法为包括每种菌株的扩增培养方法，和强化培养基配方以及培养条件和操作方法，其中菲和芘联合有氧降解的共生菌群应用于反应器装置中的生物胞外聚合物，其中反应器装置包括管道、菌剂球组，菌剂球组内部负载四种菌株制作的生物胞外聚合物，本发明专利技术的优点在于有氧环境下实现化工废水中菲和芘的生物降解，处理过程无二次污染，不仅可节约资源且有利于保护生态环境，最终达到治理难降解有机物菲和芘的目的。有机物菲和芘的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及化工废水生物处理领域，具体涉及一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]在石化工业废水的处理工艺中，持久性有机污染物是一类重要的污染物，因其具有环境持久性、生物累积性、长距离迁移能力和高生物毒性的四个特性而备受国际关注，对人类的身体健康以及环境造成了极大的威胁，目前己成为世界各国高度重视的环境问题。2013年8月，十二届全国人大常委会第四次会议批准《〈关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约〉新增列九种持久性有机污染物修正案》，截至2011年5月，已经列入斯德哥尔摩公约受控物质清单的共有22种物质，其中，多环芳烃(是由两个和两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的稠环化合物，是一类广泛存在于环境中的重要的有毒有机污染物)，具有极强致癌性、致突变性及致畸性和生物积累效应，难降解，分布广泛，具有疏水性、蒸汽压小及辛醇——水分配系数高的特点，当连接的苯环数目越多，其脂溶性增强，水溶性减小，正辛醇
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水的分配系数也越大，因此很容易被吸附在土壤或沉积物中。通常是以固体状态存在环境，其存在时间越长，遗传毒性越高，致癌性亦随苯环数增加而培强由丁脂溶性高而很容易被动物的肠同吸收，并能通过食物链在动植物体内逐级富集，对人类身体健康具有很大的危害。
[0003]菲和芘等多环芳烃的生物毒性主要作用机制是：由于其化学结构特性，能稳定地吸收可见光和紫外线，所以它对紫外线福射的光化学效应极其敏感。在细胞内，有氧呼吸产生超氧阴离子自由基、羟基自由基会，对细胞组织造成一定的损伤，长时间暴露在紫外线和菲、芘联合作用下，超氧由基的形成速度翻倍提升，对细胞造成极大损伤。另外，在脂质体的过氧化的代谢中，自由基对细胞膜造成损伤，严重的还会对细胞内的细胞器(如核糖体、线粒体)造成严重的损伤，在蛋白结构变异、酶失去活性、断链等的长期影响下，细胞组织器官便逐渐发生病变。第三，生物体尤其是高等生物接触到菲和芘之后，会被生物体内细胞色素依赖的混合氧化酶系所氧化和羟基化，葡萄糖醛酸、谷氨酰胺等这些内源性分子会与菲和芘的不完全代谢物结合，形成更高毒性而且不易排放的中间产物，这些大分子经过混合氧化酶系的氧化作用，很多会直接转化为致癌物。据有关芳香径类致癌物的活性与结构研宄报告显示，及其产物是通过蛋白质的酮一稀醇互变异构过程中某一种催化作用，从而导致蛋白的不可逆转变，最终导致细胞癌变。
[0004]目前菲和芘的污水处理主要是化工污水中常用的芬顿氧化法或臭氧氧化法等化学方法，这个过程虽然与常规加氧生物降解相比，化学降解的速率较高，成本低，但是由于氧化的作用产生的中间产物分子量比母体大，只有部分能被完全转化为无毒、低分子量的产物，其他大部分仍滞留在环境中，造成二次污染。同时，许多有毒中间产物在产生后很难被生物利用，甚至具有更大的毒性，例如，芘是会转化成一种更有毒的中间体二醇芘，并造成毒性累积。
[0005]基于上述缺陷，专利技术一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，利用生物处理方式对含有菲和芘等多环芳烃的化工污水进行有效处理。

技术实现思路

[0006]为克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，菲和芘联合生物降解，苯并吡喃
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羧酸，且进入生物循环，不产生有毒副产物积累，无二次污染，成本低廉，相比较于氧化法降解有很大优势。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，所述菲和芘联合有氧降解的共生菌群使用四种菌株，分别为假单胞菌属(Pseudomonas.sp,GenBank:GCA_000006765.1)、芽孢杆菌属(Bacillus.sp,GenBank:AY881640.1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp,GenBank:AB000106.1)、无色杆菌属(achromobacter.sp,GenBank:GCA_004296055.1)，所述构建方法为包括每种菌株的扩增培养方法，和强化培养基配方以及培养条件和操作方法，如下所述：
[0009]先将四种菌株分别接菌复苏，并在牛肉膏蛋白胨培养基扩增培养，23
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24小时，牛肉膏蛋白胨的组成为：牛肉浸膏5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l，然后四种菌株分别按照以下步骤进行强化：
[0010](一)假单胞菌属(Pseudomonas.sp)驯化改良培养基A
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D：
[0011]步骤一，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基A：可溶性淀粉20g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间1
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3小时后，转入培养基B；步骤二，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基B：可溶性淀粉10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间5
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8小时后，转入培养基C；步骤三，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基C：可溶性淀粉5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10
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18小时后，转入培养基D；步骤四，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基D：可溶性淀粉1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10
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18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000
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1200rpm，时长10分钟，或离心力1400
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1600g，离心时长10分钟；
[0012](二)芽孢杆菌属(Bacillus.sp)驯化改良培养基A
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D：
[0013]步骤一，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间1
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3小时后，转入培养基B；步骤二，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，其特征在于，所述菲和芘联合有氧降解的共生菌群使用四种菌株，分别为假单胞菌属(Pseudomonas.sp,GenBank:GCA_000006765.1)、芽孢杆菌属(Bacillus.sp,GenBank:AY881640.1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp,GenBank:AB000106.1)、无色杆菌属(achromobacter.sp,GenBank:GCA_004296055.1)，所述构建方法为包括每种菌株的扩增培养方法，和强化培养基配方以及培养条件和操作方法，如下所述：先将四种菌株分别接菌复苏，并在牛肉膏蛋白胨培养基扩增培养，23
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24小时，牛肉膏蛋白胨的组成为：牛肉浸膏5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l，然后四种菌株分别按照以下步骤进行强化：(一)假单胞菌属(Pseudomonas.sp)驯化改良培养基A
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D：步骤一，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基A：可溶性淀粉20g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间1
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3小时后，转入培养基B；步骤二，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基B：可溶性淀粉10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间5
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8小时后，转入培养基C；步骤三，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基C：可溶性淀粉5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10
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18小时后，转入培养基D；步骤四，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基D：可溶性淀粉1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10
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18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000
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1200rpm，时长10分钟，或离心力1400
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1600g，离心时长10分钟；(二)芽孢杆菌属(Bacillus.sp)驯化改良培养基A
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D：步骤一，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间后，转入培养基B；步骤二，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间5
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8小时后，转入培养基C；步骤三，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基C：无水葡萄糖5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间10
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18小时，转入培养基D；步骤四，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间10
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18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000
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1200rpm，时长10分钟，或离心力1400
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1600g，离心时长10分钟；(三)鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基A
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D：步骤一，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素
0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间1
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3小时后，转入培养基B；步骤二，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间5
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8小时后，转入培养基C；步骤三，鞘氨醇单胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙大志，徐亮，孙彩云，
申请(专利权)人：吉林化工学院，
类型：发明
国别省市：