【技术实现步骤摘要】
一种病毒样本灭活裂解试剂盒及其应用
[0001]本申请是申请号为“2020101751855”、专利技术名称为“一种病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其应用”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]本专利技术涉及病毒的生物检测
,具体涉及一种病毒灭活试剂盒、病毒核酸捕获试剂盒、实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其应用,尤其是涉及将采集灭活裂解一体化、特异性靶标磁性捕获和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合在一起的病毒特别是2019新型冠状病毒(2019
‑
nCoV)前处理及检测相关试剂盒及其应用。
技术介绍
[0003]新型冠状病毒(2019Novel Coronavirus,2019
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nCoV)是一种RNA病毒,它的遗传物质是核糖核酸,其特异性核酸序列是区分这一病毒与其他病原体的标志物。而新型冠状病毒核酸检测目的就是为了在感染患者体内找到该病毒的存在。新型冠状病毒检测目前普遍采用的是核酸检测方法包括病毒RNA提取和第二代实时荧光定量PCR技术。病毒RNA 提取过程即为前处理过程,其中将标本(咽拭子、口咽拭子、痰液和肺泡灌洗液等)中的病毒RNA纯化分离。荧光定量PCR核酸检测的技术原理是先将新型冠状病毒RNA逆转录为DNA,再将标本中的特定核酸序列进行扩增,理论上进行30次左右的扩增,其核酸数量达就可达到一定的检测标准,再通过荧光等常规方式进行检测。
[0004]目前,已有多个国家和地区发布2019
‑
nCoV的确诊检测方法。中国疾病预 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种病毒样本灭活裂解试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括用于配制灭活裂解液的如下试剂:铵盐、异硫氰酸胍、氯化锂、乙二胺四乙酸、乙二醇双(2
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氨基乙基醚)四乙酸、表面活性剂、抗坏血酸、二硫苏糖醇和缓冲剂。2.根据权利要求1所述的灭活裂解试剂盒,其特征在于:所述铵盐选自由硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、溴化铵和碘化铵组成的组,优选的是,所述铵盐为氯化铵;所述表面活性剂选自由Span
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80、Span
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20、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸钠、Tween 20、Triton X
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100、NP40、十二烷基肌氨酸钠和CTAB组成的组,优选为TritonX
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100和十二烷基硫酸锂的组合;和/或所述缓冲剂选自由Tris碱、磷酸盐和HEPES组成的组;优选的是,所述灭活裂解液用水配制,并且包含0.01
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2M铵盐,0.5
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2M异硫氰酸胍,0.1
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0.5M氯化锂,5
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50mM乙二胺四乙酸,1
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20mM乙二醇双(2
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氨基乙基醚)四乙酸,0.1
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5%表面活性剂,10
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500mM抗坏血酸,0.5
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5%二硫苏糖醇和20
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500mM缓冲剂;更优选的是,所述灭活裂解液中的铵离子的浓度为0.05M至0.5M,优选为0.1M至0.4M,更优选0.1M至0.2M;所述灭活裂解液中的表面活性剂为0.2%TritonX
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100和0.5%十二烷基硫酸锂的组合;和/或所述缓冲剂为HEPES,优选的是,HEPES的浓度为50
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200mM,更优选的是,所述灭活裂解液的pH值为5
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6.5。3.一种病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括;(1)权利要求1或2所述的病毒样本灭活裂解试剂盒;(2)靶核酸磁性捕获试剂或靶核酸捕获试剂盒;(3)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒,其特征在于:所述靶核酸磁性捕获试剂包括:(1)作为固相载体的磁性高分子微球,所述磁性高分子微球包括由γFe2O3和Fe3O4磁性材料制成的微球体和包被所述微球体的一层或多层多聚材料,并且所述磁性高分子微球的表面修饰有微球连接基团;(2)中间探针,所述中间探针包括5
’
修饰非核苷酸单元、3
’
修饰寡聚核苷酸单元和可选的中间臂,并且所述中间探针通过所述微球连接基团与所述5
’
修饰非核苷酸单元结合来与所述磁性高分子微球连接;(3)捕获探针,所述捕获探针包括与靶核酸特异性互补的5
’
特异性序列和3
’
polyA序列;优选的是,所述靶核酸为表征目标微生物存在的特异性序列,更优选的是,所述目标微生物为2019
‑
nCoV;更优选的是,所述3
’
polyA序列的长度为10
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50碱基,更优选为10
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30碱基。5.根据权利要求4所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒,其特征在于:所述多聚材料通过乳液聚合、无皂聚合、分散聚合或种子溶胀聚合来包被所述微球体;所述磁性高分子微球的粒径为0.1
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10μm,优选为0.5
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5μm,更优选为选自由Dynabeads M270 Streptavidin、Dynabeads MyOne Streptavidin T1、Merck羧基磁珠M1
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200/20、Merck氨基磁珠M2
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070/40、Agilent LodeStars 2.7Carboxyl组成的组;所述微球连接基团为活性基团或亲和蛋白,优选的是,,所述亲和蛋白为链霉亲和素;所述活性基团选自由羧基、氨基、环氧基、NHS基团、叠氮基团、甲苯磺酰基和氯甲基组成的组,优选为羧基或甲苯磺酰基;所述5
’
修饰非核苷酸单元选自由氨基、羧基和生物素组成的组;所述3
’
修饰寡聚核苷酸单元选自由Oligo dT、Oligo dU、Oligo dT VN或Oligo dU VN组成的组,其中,V选自由A、G和C组成的组,并且N选自由T、A、G和C组成的组;优选的是,所述3
’
修饰寡聚核苷酸中的寡聚T或者寡聚U中的核苷酸数目为5
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100,更优选为10
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50;所述可选的中间臂为PEG和/或Cn,其中PEG的分子量为100
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600,优选为100
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200;Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基,更优选n为2
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12;所述中间臂的长度为5
‑
50A
°
,更优选为10
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30A
°
;和/或所述捕获探针为针对2019
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nCoV的捕获探针,并且所述5
’
特异性序列为orf1ab基因上的特异性序列和/或N蛋白基因位置上的特异性序列;优选的是,所述5
’
特异性序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示;进一步优选的是,所述捕获探针如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示。6.根据权利要求4或5所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒,其特征在于:所述微球连接基团为链霉亲和素,5
’
修饰非核苷酸单元为生物素;所述中间探针选自由5
’
biotin Oligo(dT)
153’
、5
’
biotin
‑
PEG
‑
Oligo(dT)
183’
、5
’
...
【专利技术属性】
技术研发人员:何宗顺,曲峰,
申请(专利权)人:苏州白垩纪生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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