一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用，涉及生物医药技术领域。首次提出EBV抗原和IFN

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体而言，涉及一种鉴定抗EBV 免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]EB病毒(Epstein
‑
Barr virus,EBV)属于人类疱疹病毒第四型，是一种双链DNA病毒，主要通过唾液传播，全球超过90％的人群都曾感染该病毒。在机体免疫功能正常时，EBV感染可以触发机体的细胞毒性T细胞(CTL)、NK细胞、γδT细胞以及迟发型超敏反应性T细胞(TDTH)对受染细胞进行免疫清除。在宿主免疫老化以及免疫功能缺陷等情况下，EBV感染无法被清除，因此引起EBV相关淋巴组织增殖性疾病(EBV
‑
associated T
‑
or NK
‑
cell lymphoproliferativediseases，EBV+T/NK
‑
LPDs)。
[0003]慢性活动性EBV感染(chronic active EBV infection，CAEBV) 是淋巴细胞增殖性疾病的一种。临床表现为初次EBV感染后反复发作或持续数月以上的IM样症状，即发热、咽峡炎、淋巴结肿大和肝脾肿大等。常常进展为恶性疾病，若不及时进行合理、有效地干预治疗，死亡率极高。目前，此类疾病的发病机制仍不明确，对疾病状态的评估主要为外周血EBV
‑
DNA的变化，外周血EBV特异性抗体情况，组织活检病理EBERs原位杂交情况。EBV的清除障碍主要为EB 病毒特异性CTL的功能缺陷，包括无法增殖及活性受损，目前无技术评估患者的抗EB病毒免疫活性。此外，对EB病毒感染相关疾病的治疗效果的评估，仅停留在临床检测EBV
‑
DNA、EBV特异性抗体、组织中EBER表达等宏观方面。
[0004]例如，对CAEBV等EBV
‑
LPD疾病的治疗效果的评估，主要集中在临床症状的改善(如发热、淋巴结肿大、肝脾肿大的变化)，以及外周血EBV
‑
DNA拷贝数的变化，组织中EBER表达的变化。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用以解决上述技术问题。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]一种EBV抗原和IFN
‑
γ单克隆抗体在制备用于检测免疫细胞抗 EBV免疫活性的ELISpot试剂盒中的应用。
[0009]针对目前对EB病毒感染相关疾病患者的免疫细胞的抗EBV免疫活性尚无评估办法，以及对治疗前后抗EBV免疫活性亦无有效评估手段，无法从免疫层面评估治疗效果，或者在治疗前从免疫层面预测可能治疗效果。
[0010]本专利技术使用ELISpot试剂盒来评估抗EBV免疫活性的变化。该试剂盒用于鉴定抗EBV免疫活性，从而辅助判断治疗效果，也可以用于治疗前的治疗效果预测，从而对临床治疗的选择提供一定的参考。
[0011]ELISpot(Enzyme
‑
Linked Immunospot Assay，酶联免疫斑点技术)。
[0012]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述用于检测免疫细胞抗 EBV免疫活性是指用于检测(EBV抗原刺激后)免疫细胞(例如T 细胞)分泌的细胞因子水平。
[0013]在其他实施方式中也可以检测加入EBV抗原和/或PD
‑
1单抗后的T细胞分泌的细胞因子的水平。
[0014]例如：检测加入EBV抗原后ELISpot实验下刺激细胞因子的水平以评估患者T细胞抗EBV免疫活性。
[0015]IFN
‑
γ作为免疫活性细胞分泌的细胞因子在诱导抗病毒免疫中起着重要的免疫调理作用，包括激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)细胞和吞噬细胞等，机体产生的IFN
‑
γ的水平实际上反映了T细胞的活动。因此，检测IFN
‑
γ的水平就是间接地检测了T细胞的活性。目前，检测IFN
‑
γ的水平已经逐渐代替各种传统的细胞免疫检测手段，成为检测细胞免疫效果的一种重要方法。
[0016]本专利技术提供了一种上述试剂盒的使用方法，首先使用EBV的肽库刺激患者的T细胞，然后使用酶联免疫斑点技术(Enzyme
‑
LinkedImmunospot Assay，ELISpot)检测抗原刺激后是否出现斑点，即IFN
‑ꢀ
γ的释放。出现斑点即为患者的T细胞可识别EBV特异性抗原肽并释放IFN
‑
γ。因此，出现斑点多少可反映T细胞的抗EBV免疫活性。
[0017]ELISpot具有如下优势：
[0018]一：灵敏度高。一百万个细胞中只要有一个细胞分泌细胞因子就可被检测出来，相对于传统的ELISA方法提升了2～3个数量级。
[0019]二：单细胞水平，活细胞功能检测。ELISpot是用抗原直接刺激活细胞，检测的是活细胞的功能。
[0020]三：操作简便经济，可进行高通量筛选。ELISpot没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法。
[0021]ELISpot就是用包被好的抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其呈现出来。
[0022]实验原理包括：
[0023]ELISpot实验使用PVDF膜为底的96孔板，包被上特异性的单克隆抗体(需要无毒，不含内毒素，亲和力高的抗体)，以捕获细胞分泌的细胞因子。
[0024]然后在培养板的孔内加入待检测的细胞和抗原刺激物进行培养。在刺激物的刺激下，T细胞就会在对应的时间段分泌对应的细胞因子。此时细胞因子就被包被在膜上的抗体所捕获。
[0025]洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点，每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞。
[0026]统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的百分比。
[0027]一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其包括EBV抗原和IFN
‑
γ单克隆抗体。
[0028]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述EBV抗原选自EBV的肽库。
[0029]在其他实施方式中，EBV抗原可以是衣壳抗原(CA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、荚膜蛋白(VCA)、膜抗原(MA)、EB 病毒潜在膜抗原(LMP)中的至少一种。此外，EBV抗原还可以是 EBV感染B细胞后合成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种EBV抗原和IFN
‑
γ单克隆抗体在制备用于检测免疫细胞抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒中的应用。2.一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，其包括EBV抗原和IFN
‑
γ单克隆抗体。3.根据权利要求2所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述EBV抗原选自EBV的肽库。4.根据权利要求3所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述EBV的肽库为PepTivator EBV Consensus。5.根据权利要求4所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述EBV的肽库是以肽库储液的形式存在于试剂盒中。6.根据权利要求2所述的鉴定抗EBV免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昭，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：