一种提高试剂稳定性的包被和封闭方法技术

本申请涉及一种提高试剂稳定性的包被和封闭方法。具体而言，涉及一种提高胶乳试剂稳定性的包被方法，其特征在于以PEG衍生物作为封闭剂来提高试剂的稳定性，并通过优化工作液的pH来达到最佳效果。本申请以PEG衍生物代替传统的封闭剂(包含BSA、或Tween、或表面活性剂的缓冲体系)，提高了胶乳试剂的热稳定性、货架稳定性及开盖稳定性。稳定性及开盖稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种提高试剂稳定性的包被和封闭方法


[0001]本申请属于体外诊断医学检验领域，涉及一种提高胶乳试剂稳定性的方法。

技术介绍

[0002]在典型的免疫分析方法中，基于抗原和抗体之间的特异性识别。亲和作用是一系列非共价相互作用(亲疏水作用、静电作用、氢键等)的总称。通常将抗体或抗原包被到固相载体上，以便于捕获样本中的目标分子。然而，在复杂的样本环境中存在各种非目标分子可能在不同程度上产生吸附，称为非特异性吸附。
[0003]例如，固相载体的表面(如ELISA板、NC膜、PVDF膜上)有很多洞，通过电转或包被将靶蛋白转移到膜上、或抗原/抗体固定在板上，蛋白以填补/堆积或吸附、或共价的方式结合于固相载体的表面。要包被的靶蛋白填补进表面的洞里，但并不是连续的，而有很多空隙并没有填进靶蛋白，而样本中其他蛋白也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。
[0004]本领域中为避免这种情况的现有技术是：封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合，以避免一抗的非特异结合，所以实现了对固相载体上空白位置的“封闭”。封闭剂应封闭所有的未结合位点，而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。
[0005]本领域中已知的封闭剂包括：
[0006]‑
BSA：是最常用的封闭剂。大部分BSA中有少量的抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，产生高背景，杂带较多或使得本底水平增高。
[0007]‑
脱脂奶粉：优点是成本低，但是由于成分相对复杂，所以适用范围窄，而且封闭后的固相载体不易长期保存。
[0008]‑
酪蛋白：和BSA作用类似。
[0009]‑
血清：封闭血清的原理包括：第一是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质，可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合；第二是待检样本中可能有Fc受体可以和抗体的恒定区结合；封闭血清中的抗体可以封闭Fc受体。但封闭血清中不能含有待测目标，且不应与一抗来源相同。
[0010]‑
非蛋白化合物：例如，甲醛用于封闭PVDF，使之失去结合蛋白的疏水力；吐温20对非特异性吸附有洗脱作用，可以降低蛋白间的疏水作用，可提高特异性抗体的识别能力。
[0011]以胶乳增强免疫比浊法(LTIA)为例，它是一种检测样本中蛋白含量或水平的均相免疫比浊方法。LTIA利用胶乳凝集作用放大样本中抗原与抗体的结合反应，用已知浓度的检测物测出的吸光度变化量，作出剂量
‑
反应曲线，未知浓度的检测物可以从该曲线推算出来。LTIA是在均相反应体系中进行抗原抗体的反应和结果的测定，抗原
‑
抗体反应后直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐的操作步骤。此外，胶乳增强免疫比浊法试剂盒的使用步骤简化，避免了许多人为操作因素和试剂，环境等外界因素的干扰，准确性和重复性都较好。
[0012]在LTIA反应体系中，结合有靶向成分(如单抗)的固相载体是胶乳颗粒。现有技术中，在胶乳颗粒和靶向成分(如单抗)结合之后，通常加入惰性蛋白(如牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA)以封闭胶乳颗粒上未结合靶向成分(如单抗)的位置，但仍会产生较高的背景信号，影响检测结果。
[0013]现有的胶乳增强免疫比浊试剂盒还面临各种稳定性问题，例如热稳定性、开盖稳定性、4℃长期稳定性(也作货架稳定性)等。
[0014]因此，有必要提供一种新的包被或封闭方法以提高试剂的稳定性。

技术实现思路

[0015]基于本领域的需求，本公开提供了一种PEG衍生物其作为封闭剂的新用途。还提供了PEG衍生物在制备封闭剂中的用途。
[0016]所述封闭剂是指固相载体的封闭剂。具体而言，本公开的封闭剂是指在临床检测、诊断、生化分析、生物技术、生物制品、生物材料领域中，用于封闭固相载体表面上未结合目标分子的空白位点的试剂。
[0017]在一些实施方案中，提供了一种PEG衍生物作为封闭剂的用途，所述PEG衍生物选自以下的一项或组合：聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺。
[0018]在一些实施方案中，提供了PEG衍生物在制备封闭剂中的用途，所述PEG衍生物选自以下的一项或组合：聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺。
[0019]在一些实施方案中，所述PEG衍生物的分子(平均分子量)是200至20000，例如200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000
±
10％；优选2000至5000。
[0020]本领域技术人员，可以根据已知方法确定聚醚多元醇的分子量。例如但不限于GB/T 12008.3
‑
2009聚醚多元醇中第3部分关于羟值的测定，从而间接确定分子量。
[0021]在一些实施方案中，所述固相载体选自以下的一项或组合：微孔板、膜、玻璃、微流控芯片、胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒。
[0022]在一些具体的实施方案中，所述固相载体是胶乳颗粒。
[0023]在一些具体的实施方案中，聚苯乙烯胶乳颗粒。
[0024]在一些具体的实施方案中，所述固相载体是微孔板。
[0025]在一些具体的实施方案中，所述固相载体是膜，比如NC膜、PVDF膜。
[0026]在一些具体的实施方案中，所述固相载体是磁颗粒。
[0027]在一些具体的实施方案中，所述固相载体是芯片。
[0028]在一些实施方案中，固相载体上带有选自以下一种的官能团或组合：羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯、环氧基。
[0029]在一些实施方案中，所述固相载体上包被有兴趣分子，所述兴趣分子选自以下的一项或组合：抗体、抗原结合片段、抗原。
[0030]在一些实施方案中，抗原选自以下的一项或组合：分子量大于等于10000Da的蛋
白、分子量小于10000Da的多肽、激素、糖、多核苷酸、脂质、小分子药物。
[0031]在优选的实施方案中，兴趣分子是分子量大于等于10000Da的蛋白、分子量小于10000Da的多肽、抗体、抗原结合片段。
[0032]根据一些实施方案，本公开提供了一种将兴趣分子包被到固相载体的方法，包括步骤：
[0033]1)提供固相载体，使所述固相载体与活化剂接触得到活化的固相载体；
[0034]2)提供兴趣分子；
[0035]3)在PEG衍生物存在时，使所述兴趣分子与所述活化的固相载体接触，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将兴趣分子包被到固相载体的方法，包括步骤：1)提供固相载体，使所述固相载体与活化剂接触得到活化的固相载体；2)提供兴趣分子；3)在PEG衍生物存在时，使所述兴趣分子与所述活化的固相载体接触，得到包被有兴趣分子的固相载体；4)使所述包被有兴趣分子的固相载体与PEG衍生物接触，得到经封闭的包被有兴趣分子的固相载体；步骤1)和步骤2)能够互换顺序或并行；所述兴趣分子选自以下的一项或组合：抗体、抗原结合片段、抗原；优选地，所述抗原选自以下的一项或组合：分子量大于等于10000Da的蛋白、分子量小于10000Da的多肽、激素、糖、多核苷酸、脂质、小分子药物；所述PEG衍生物选自以下的一项或组合：聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺；所述PEG衍生物的分子量是200至20000，优选2000至5000；所述固相载体选自以下的一项或组合：微孔板、膜、玻璃、微流控芯片、胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒；优选地，所述固相载体是胶乳颗粒；优选地，所述固相载体带有选自以下的活性官能团：羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯、环氧基、或其组合；所述活化剂的当量是所述固相载体的活性官能团的1倍至2倍；优选，所述活化剂选自以下的一项或组合：EDC、NHS、DCC、DIC。2.根据权利要求1所述的方法，其中：当所述固相载体选自以下的一项或组合时，在缓冲液中提供所述固相载体：胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒；所述缓冲液的pH是6至10，优选7.0至8.5；所述缓冲液选自：Hepes、PIPES、MES、甘氨酸缓冲液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中：步骤1)中，在18℃至40℃，优选22℃至37℃，使所述固相载体与所述活化剂接触20min至3h；和/或步骤3)中，在18℃至40℃，优选22℃至37℃使所述兴趣分子与所述活化的固相载体接触2h至5h；和/或步骤4)中，在18℃至40℃，优选22℃至37℃使所述包被有兴趣分子的固相载体与所述PEG衍生物接触12h至24h。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：步骤2)中，所述兴趣分子的量是0.5mg/每平方米至5mg/每平方米固相载体表面积；优选1.5mg/每平方米至2.5mg/每平方米固相载体表面积。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中：
在步骤3)中，所述PEG衍生物和所述兴趣分子的比例为按质量计0.6：1至4：1，优选1.2：1至2：...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓娟，张小锐，蔡华雅，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：