一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括以下步骤：首先采用菌丝诱导实验获得以菌丝相生长的白色念珠菌，然后用转录组测序方法（RNA

【技术实现步骤摘要】
一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法


[0001]本专利技术涉及白色念珠菌毒力相关基因的
，具体为一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法。

技术介绍

[0002]白色念珠菌（Candida albicans）是真菌中最常见的人类病原菌，是健康宿主皮肤、黏膜和消化道正常菌群的组成部分，然而，当免疫防御系统受损或正常菌群平衡被破坏时，其就会转化为机会性致病杀手，可引起浅表黏膜感染或全身性疾病，并导致较高死亡率，事实上，念珠菌的传播是导致艾滋病患者口咽疾病、女性外阴阴道炎症，以及糖尿病患者、早产儿和外科患者侵袭性真菌病的主要原因。这其中包括了白色念珠菌与上皮细胞直接接触破坏上皮细胞；血管内植入被污染的器材以及在外伤及外科手术处理时进入血液，趁机通过黏附和渗入血管内皮而进入深部脏器引起一些易感人群全身性感染；以及穿过血管进入组织中激活固有免疫细胞（如巨噬细胞）进而引起的一系列“遭遇战”，无论是念珠菌的浅表性感染还是系统性感染，在此过程中念珠菌与宿主细胞间的相互作用结果都将决定了感染的最终结局。白色念珠菌是一种形态双相型真菌，能够在各种环境下以各种可逆形态如酵母型（Y）、假菌丝型或菌丝型（H）生长，念珠菌由酵母向菌丝的转变（yeast
‑
to
‑
hyphae transition）能力已被证明对其致病性是必需的，除了从形态转变可作为一种毒力特性，念珠菌也可介导多种侵袭性酶入侵宿主组织以及逃避宿主抗真菌感染免疫，在白念珠菌的致病中起到关键作用。本研究拟对白色念珠菌分别感染人阴道上皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人单核源性巨噬细胞后从念珠菌的菌丝形成、细胞黏附、侵袭性酶等毒力基因的表达方面进行对比分析，这项研究目前尚未见报道，研究结果拟以对念珠菌与不同宿主细胞相互作用机制的深入研究，对由正常定植状态转变为具有较高毒力的感染状态的念珠菌毒力基因及时诊断提供有价值的依据和线索，所以我们提出了一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，以便于解决上述中提出的问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，以解决上述
技术介绍
中提出对白色念珠菌分别感染人阴道上皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人单核源性巨噬细胞后从念珠菌的菌丝形成、细胞黏附、侵袭性酶等毒力基因的表达方面进行对比分析，这项研究目前尚未见报道，研究结果拟以对念珠菌与不同宿主细胞相互作用机制的深入研究，对由正常定植状态转变为具有较高毒力的感染状态的念珠菌毒力基因及时诊断提供有价值的依据和线索的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括：步骤1：准备好菌株，细胞系和主要材料
菌株：白色念珠菌SC5314株，购自北纳生物菌种收藏中心，菌株在沙堡罗琼脂平板上活化培养后，实验前一天于新鲜配制液体YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖、50μg/ml氯霉素）培养基中30℃，220 r/min过夜培养，达对数相生长后用于实验；人单核细胞系THP
‑
1、人阴道上皮细胞系VK2/E6E7和人脐静脉内皮细胞系HUVEC均购自中科院上海细胞库，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640细胞培养液传代培养；步骤2：菌丝诱导实验取对数生长相的白色念珠菌菌液，收集、清洗、计数；步骤3：转录组测序与数据分析按说明书方法提取菌丝诱导前和诱导后的白色念珠菌的总RNA，将质检合格的总RNA样本（包含生物学重复）送至华大基因进行转录组测序（RNA
‑
seq）分析，测序原始数据经过预处理后，得到白色念珠菌菌丝诱导前后各样本的有效转录组数据；步骤4：细胞毒性分析取过夜培养的白色念珠菌菌液，收集、洗涤、计数后备用；步骤5：念珠菌感染宿主细胞的形态学观察胰酶消化、收集并洗涤HUVEC、VK2/E6E7或PMA处理的THP
‑
1细胞单层，用含1%FBS的 RPMI
‑
1640培养液调整细胞数为2
×
106/ml；步骤6：逆转录和荧光定量PCR分析（qRT
‑
PCR）按照感染复数1（念珠菌:HUVEC细胞）或0.1（念珠菌:VK2/E6E7或THP
‑
1细胞）建立1 h、2 h、4 h和8 h感染模型，裂解处理宿主细胞后，4℃离心收集菌体，分别提取上述各时间点的念珠菌总RNA，按逆转录酶操作说明配制20 ml逆转录体系，于42℃反应60 min，70℃加热5 min终止反应；步骤7：统计学分析所获得实验数据均以多次实验结果平均值
±
标准偏差表示。
[0005]优选的，所述步骤1中悬浮生长状态的人单核细胞THP
‑
1在实验前需经10 ng/ml 佛波酯（PMA）诱导分化48 h待贴壁培养后方可用于后续研究，主要仪器：生化培养箱、CO2细胞培养箱、生物安全柜、恒温摇床、正置显微镜、倒置显微镜、多功能酶标仪、荧光定量PCR仪、细胞计数仪、微量高速离心机、台式大容量离心机；其他主要试剂：RNA提取试剂盒、溶壁酶、逆转录酶、SYBR荧光定量PCR试剂、革兰氏染色试剂。
[0006]优选的，所述步骤2中新鲜配制下列菌丝诱导液：
①
RPMI 1640细胞培养液；
②
FBS；
③
无菌水配制的10% FBS（v/v）；
④
含10% FBS的 RPMI 1640细胞培养液；
⑤
无菌水；
⑥
YPD液体培养基。用YPD调整菌数为5
×
106/ml，取样镜检拍照，作为菌丝诱导前的对照，对应不同诱导条件，于37℃恒温培养箱内分别孵育1 h、2 h、3 h和4 h，每个时间点取菌液，于显微镜下观察菌丝形成情况，拍照记录，每种菌丝诱导体系的每个时间点各设置一个平行对照。
[0007]优选的，所述步骤3中在RNA
‑
seq在线数据分析平台通过样本属性、样本表达量、实验组间差异和基因注释等条件选择后，分析侵袭性酶类、菌丝形成、细胞黏附等念珠菌毒力基因在菌丝诱导前后的差异表达，差异倍数以log2表示，对log2
³
2的高可信度差异表达基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO），此外，根据差异基因GO结果进一步挖掘，用生物学功能注释的标准词汇表术语（GO term）筛选出与菌丝形成、致病性、细胞黏附、与宿主细胞
相互作用等与白色念珠菌毒力可能相关的新候选基因。
[0008]优选的，所述步骤4中过夜培养的VK2/E6E7、HUVEC和经PMA处理的THP
‑
1细胞单层细胞经胰酶消化、收集和PBS洗涤后用细胞培养液重悬并调整细胞数量至5
×
104个动物细胞/ml，按100 ml/孔加入96孔细胞培养板指定位置，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括：步骤1：准备好菌株，细胞系和主要材料菌株：白色念珠菌SC5314株，购自北纳生物菌种收藏中心，菌株在沙堡罗琼脂平板上活化培养后，实验前一天于新鲜配制液体YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖、50μg/ml氯霉素）培养基中30℃，220 r/min过夜培养，达对数相生长后用于实验；人单核细胞系THP
‑
1、人阴道上皮细胞系VK2/E6E7和人脐静脉内皮细胞系HUVEC均购自中科院上海细胞库，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640细胞培养液传代培养；步骤2：菌丝诱导实验取对数生长相的白色念珠菌菌液，收集、清洗、计数；步骤3：转录组测序与数据分析按说明书方法提取菌丝诱导前和诱导后的白色念珠菌的总RNA，将质检合格的总RNA样本（包含生物学重复）送至华大基因进行转录组测序（RNA
‑
seq）分析，测序原始数据经过预处理后，得到白色念珠菌菌丝诱导前后各样本的有效转录组数据；步骤4：细胞毒性分析取过夜培养的白色念珠菌菌液，收集、洗涤、计数后备用；步骤5：念珠菌感染宿主细胞的形态学观察胰酶消化、收集并洗涤HUVEC、VK2/E6E7或PMA处理的THP
‑
1细胞单层，用含1%FBS的 RPMI
‑
1640培养液调整细胞数为2
×
106/mL；步骤6：逆转录和荧光定量PCR分析（qRT
‑
PCR）按照感染复数1（念珠菌:HUVEC细胞）或0.1（念珠菌:VK2/E6E7或THP
‑
1细胞）建立1 h、2 h、4 h和8 h感染模型，裂解处理宿主细胞后，4℃离心收集菌体，分别提取上述各时间点的念珠菌总RNA，按逆转录酶操作说明配制20 mL逆转录体系，于42℃反应60 min，70℃加热5 min终止反应；步骤7：统计学分析所获得实验数据均以多次实验结果平均值
±
标准偏差表示。2.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤1中悬浮生长状态的人单核细胞THP
‑
1在实验前需经10 ng/ml 佛波酯（PMA）诱导分化48 h待贴壁培养后方可用于后续研究，主要仪器：生化培养箱、CO2细胞培养箱、生物安全柜、恒温摇床、正置显微镜、倒置显微镜、多功能酶标仪、荧光定量PCR仪、细胞计数仪、微量高速离心机、台式大容量离心机；其他主要试剂：RNA提取试剂盒、溶壁酶、逆转录酶、SYBR荧光定量PCR试剂、革兰氏染色试剂。3.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤2中新鲜配制下列菌丝诱导液：
①
RPMI 1640细胞培养液；
②
FBS；
③
无菌水配制的10% FBS（v/v）；
④
含10% FBS的 RPMI 1640细胞培养液；
⑤
无菌水；
⑥
YPD液体培养基。用YPD调整菌数为5
×
106/ml，取样镜检拍照，作为菌丝诱导前的对照，对应不同诱导条件，于37℃恒温培养箱内分别孵育1 h、2 h、3 h和4 h，每个时间点取菌液，于显微镜下观察菌丝形成情况，拍照记录，每种菌丝诱导体系的每个时间点各设置一个平行对照。4.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在
于：所述步骤3中在RNA
‑
seq在线数据分析平台通过样本属性、样本表达量、实验组间差异和基因注释等条件选择后，分析侵袭性酶类、菌丝形成、细胞黏附等念珠菌毒力基因在菌丝诱导前后的差异表达，差异倍数以log2表示，对log2
³
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜蓬，刘小香，孙爱华，李翔，杜程飞，钱淼淼，陈文虎，李晓燕，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：