一种重组猫干扰素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组猫干扰素的制备方法，该方法通过优化猫ω干扰素的序列以及去除原有信号肽，构建原核表达重组质粒。经过培养携带该重组质粒的大肠杆菌获得种子液，接种菌液然后经低温诱导获得发酵菌液，经离心，破碎，收获上清可溶性蛋白，最后经过镍柱亲和层析和透析超滤获得猫干扰素。该方法的优势在于根据大肠杆菌密码子偏好进行序列优化，同时去除原核表达中不需要的信号肽以及采用低温诱导，提高了原本在包涵体中表达的蛋白的可溶性，进一步简化了纯化工艺并提高了蛋白活性。步简化了纯化工艺并提高了蛋白活性。步简化了纯化工艺并提高了蛋白活性。

【技术实现步骤摘要】
一种重组猫干扰素的制备方法


[0001]本专利技术属于生物领域，具体涉及一种重组猫干扰素的制备方法。

技术介绍

[0002]猫干扰素是一种具有较强抗病毒能力的糖蛋白，临床上已经将其用于防治猫细小病毒病、猫传染性腹膜炎、猫水泡口炎病毒病等。随着分子生物学的发展，利用基因工程的方法将体外合成的干扰素已经获得成功。大肠杆菌表达系统因其具有高效、成本低廉等先天优势，成为现有技术中生产猫干扰素等蛋白的首要选择，但由于其表达效率过高、速度过快，往往使表达的外源蛋白不能正确折叠形成具有正确空间结构和特定生物学功能的蛋白质，表达产物常以不可溶的包涵体形式存在，因此将大肠杆菌表达系统表达的猫干扰素用于临床须进行蛋白复性，溶解包涵体需要高浓度的裂解液(8M尿素)，在后期去除裂解液的过程中由于难以控制裂解液的置换速率，常由于环境变化过于剧烈导致复性产物再次聚集失活。此外，为保证复性产物不再次聚集失活，在置换裂解液的过程中需要大量含有相对低浓度裂解液的置换液，而大量置换液的引入又会导致过低的复性收率，且由于置换步骤多导致成本高耗时长不适合规模化生产。因此，市场上大规模生产重组干扰素采用杆状病毒表达系统进行真核表达，成本较高，周期较长。本专利技术建立一套提高重组猫干扰素可溶性和活性的原核表达系统，使原核表达猫干扰素投入临床应用成为可能。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种重组猫干扰素的制备方法，旨在通过序列优化和低温诱导提高猫干扰素在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达，同时还提高蛋白的抗病毒活性。
[0004]为实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0005]一种重组猫干扰素的制备方法，其具体步骤为：
[0006]1)根据大肠杆菌密码子偏好优化猫干扰素基因序列，并去除原有信号肽，优化后的序列如SEQ ID NO.2所示；
[0007]2)构建含有上述猫干扰素基因优化序列的重组质粒的大肠杆菌表达体系，并培养以获得种子液；
[0008]3)种子液经扩大培养后诱导表达，得到发酵菌液；
[0009]4)发酵菌液经破碎、离心后得到可溶性重组蛋白的上清液；
[0010]5)上清液经过镍柱亲和纯化以及透析、超滤后得到重组猫干扰素。
[0011]优选地，步骤2)中所述的大肠杆菌表达载体为pET
‑
32a。
[0012]优选地，步骤3)中所述的诱导表达温度为18℃。
[0013]优选地，步骤3)中所述的诱导表达IPTG终浓度为0.6
‑
0.8mmol/L。
[0014]优选地，步骤3)中所述的诱导表达时间为12
‑
16小时。
[0015]优选地，步骤5)中所述的透析所用透析袋规格为10
‑
15kd。
[0016]优选地，步骤5)中所述的超滤所用超滤管规格为10kd。
[0017]优选地，步骤5)中所述的透析所用溶剂以及所述的超滤所用置换溶液均为磷酸盐平衡生理盐水缓冲液。
[0018]采用上述技术方案，本专利技术具有的有益效果为：
[0019]1.本专利技术通过对猫干扰素序列根据大肠杆菌密码子偏好并去除原有信号肽进行优化，提高了重组蛋白的可溶性，减少了其在包涵体中的表达，从而使其能更好地应用于临床，本专利技术所使用的表达系统成本低廉，容易获得。
[0020]2.本专利技术通过优化诱导温度，进一步提高了重组蛋白在上清液中的表达量。
[0021]3.本专利技术制备的重组猫干扰素安全性好，抗病毒活性高。试验证明，其对CRFK细胞的最大安全浓度达47.4μg/mL，对VSV
‑
GFP病毒的TCID50达10
6.4
/100μL，活性优于现有商品化真核表达的FeIFN
‑
ω。
[0022]4.本专利技术还具有生产成本低，工艺简单，蛋白得率高等优点。
附图说明
[0023]图1.优化前后FeIFN
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ω2核酸序列的比较结果。
[0024]图2.FeIFN
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ω2的PCR扩增结果，M.marker 2000；1
‑
5.FeIFN
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ω2优化序列扩增条带。
[0025]图3.不同温度下pET
‑
32a
‑
FeIFN
‑
ω2序列优化前后的诱导表达情况；
[0026]A)序列优化前的重组干扰素表达，M.蛋白标准分子量；1.pET
‑
32a
‑
FeIFN
‑
ω2 37℃诱导上清；2.pET
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32a
‑
FeIFN
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ω2 37℃诱导沉淀；pET
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32a
‑
FeIFN
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ω2 26℃诱导上清；pET
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32a
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FeIFN
‑
ω2 26℃诱导沉淀；pET
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32a
‑
FeIFN
‑
ω2 18℃诱导上清；pET
‑
32a
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FeIFN
‑
ω2 18℃诱导沉淀；
[0027]B)序列优化后的重组干扰素表达，M.蛋白标准分子量；1.pET
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32a
‑
FeIFN
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ω2 37℃诱导上清；2.pET
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32a
‑
FeIFN
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ω2 37℃诱导沉淀；pET
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32a
‑
FeIFN
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ω2 26℃诱导上清；pET
‑
32a
‑
FeIFN
‑
ω2 26℃诱导沉淀；pET
‑
32a
‑
FeIFN
‑
ω2 18℃诱导上清；pET
‑
32a
‑
FeIFN
‑
ω2 18℃诱导沉淀。
[0028]图4.pET
‑
32a
‑
FeIFN
‑
ω2纯化情况，M.蛋白标准分子量；1.pET32a未诱导菌液；2.pET32a诱导菌液；3.pET32a
‑
FeIFN
‑
ω2 18℃诱导菌液；pET32a
‑
FeIFN
‑
ω2 18℃诱导菌液上清；pET32a
‑
FeIFN
‑
ω2重组蛋白的His
‑
tag亲和层析纯化结果。
[0029]图5.重组FeIFN
‑
ω2对CRFK的细胞毒性。
具体实施方式
[0030]通过以下实施例对本专利技术作进一步的详细描本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组猫干扰素的制备方法，其特征在于包括：1)根据大肠杆菌密码子偏好优化猫干扰素基因序列，并去除原有信号肽，优化后的序列如SEQ ID NO.2所示；2)构建含有上述猫干扰素基因优化序列的重组质粒的大肠杆菌表达体系，并培养以获得种子液；3)种子液经扩大培养后诱导表达，得到发酵菌液；4)发酵菌液经破碎、离心后得到可溶性重组蛋白的上清液；5)上清液经过镍柱亲和纯化以及透析、超滤后得到重组猫干扰素。2.根据权利要求1所述的重组猫干扰素的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的大肠杆菌表达载体为pET
‑
32a。3.根据权利要求1所述的重组猫干扰素的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述的诱导表达温度为18℃。4.根据权利要求1所述的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔旻，刘皓轩，
申请(专利权)人：武汉康湃特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：