改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括样品采集、染色、凝胶管制备和电泳四个步骤，其中样品采集包括采集空腹12h以上的静脉血样品，在3h内对血清进行分离，若不能及时测定，将血清样本放置在

【技术实现步骤摘要】
改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法。

技术介绍

[0002]血浆脂蛋白是负责胆固醇、甘油三酯和磷脂运输的球形颗粒。脂蛋白可以分为五大类，包括乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。其中LDL(Low
‑
density lipoprotein)是一组由大小、密度、化学成分不同的亚组分颗粒组成的异质性脂蛋白,单个LDL颗粒的直径约为2.20
×
103
‑
2.75
×
103nm，通常运送3000至6000个脂肪分子/颗粒，其大小随颗粒内脂肪分子的数量而变化。目前，可以将LDL分离为7个LDL亚组分，分别命名为LDL
‑
1至LDL
‑
7，其中LDL
‑
1由最大的颗粒组成，LDL
‑
7由最小的颗粒组成。
[0003]LDL的亚组成和比例受基因，环境，遗传等影响，已知年龄、性别和脂质状态会影响LDL亚组分[7]。脂蛋白电泳谱主要由颗粒较大的LDL
‑
1和LDL
‑
2亚组分组成，称之为“A型”。除LDL
‑
1和LDL
‑
2之外，还包括LDL
‑
3至LDL
‑
7亚组分，该部分由颗粒较小、密度较大的脂蛋白组成，称为“B型”[Austin MA,King MC,Vranizan KM,Krauss RM.Atherogenic lipoprotein phenotype.A proposed genetic marker for coronary heart disease risk.CircuLation 1990；82:495
–
506.]。研究表明[Campos H,Genest JJ Jr,Blijlevens E,McNamara JR,Jenner JL,Ordovas JM,et al.Low density lipoprotein particle size and coronary artery disease.Arterioscler Thromb 1992；12:187
–
95.]，B型LDL与冠状动脉疾病(CAD)的发生具有高的相关性【Coresh J,Kwiterovich PO Jr,Smith HH,Bachorik PS.Association of plasma triglyceride concentration and LDL particle diameter,density,and chemical composition with premature coronary artery disease in men and women.J Lipid Res 1993；34:1687
–
97.】，而与性别、年龄和体重无关，因此低高密度脂蛋白是一个能够预测冠状动脉疾病(CAD)的指标[Gardner CD,Fortmann SP,Krauss RM.Association of small low
‑
density lipoprotein particles with the incidence of coronary artery disease in men and women.JAMA1996；276:875
–
81.]，血清中高浓度的低密度脂蛋白被认为是形成冠心病的主要因素。当LDL颗粒被氧化时，就会增加患心血管疾病的风险，这主要因为氧化形式的LDL更容易被血管壁上蛋白聚糖所截留，并产生一系列复杂的生化调节反应，随着时间的推移，LDL颗粒浓度的逐渐增加，将导致动脉粥样硬化【陈华新主编.冠心病防治一本通.北京：金盾出版社，2012：31】。
[0004]脂蛋白的分析方法有密度梯度超离心化[Griffin BA,Caslake MJ,Yip B,Tait GW,Packard CJ,Shepherd J.Rapid Isolation Of Low Density Lipoprotein(LDL)Subfractions From Plasma By Density Gradient uLtracentrifugation.Atherosclerosis 1990；83(1):59
‑
67]，该方法是金标准【Nehemias Mun～iz.Measurement of plasma lipoproteins by electrophoresis on polyacrylamide gel.Clin.Chem.1977:23/10,
1826
‑
1833】，但该方法需要超离设备，而且操作时间长，不能进行大批量进行检测。核磁共振(NMR)[Otvos JD.Measurement of Lipoprotein Subclass Profiles by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy.In:Handbook Of Lipoprotein Testing,Rifai N,Warnick GR,Dominiczak MH,Eds.AACC Press,1999,2nd Edition,Washington,DC.Pages 609
‑
623.]自1991年就已用来检测血浆中的脂蛋白【Otvos JD,Jeyarajah EJ,Bennett DW.Quantification of plasma lipoproteins by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy.Clin Chem 1991；37:377
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86.】。血浆中不同大小的VLDL、LDL、HDL亚型同时发出不同的NMR信号，其单次振幅可准确、可重复测量；所测得的亚类信号振幅与发出信号的亚类粒子的数目成正比，而与颗粒脂质组成的变化无关【Jeyarajah EJ1,Cromwell WC,Otvos JD.Lipoprotein particle analysis by nuclear magnetic resonance spectroscopy.Clin Lab Med.2006Dec；26(4):847
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70】,该方法同样需要贵重的仪器设备，操作时间长以及不能够高通量的进行检测，而且对操作人员要求高。凝胶电泳方法是目前最常用的检测方式【Shaina V.Hirany,Yusra Othman,Patricia Kutscher,David L.Rainwater,Ishwarlal Jialal and Sridevi Devaraj.Comparison本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1，样品采集：采集空腹12h以上的静脉血样品，在3h内对血清进行分离，若不能及时测定，将血清样本放置在
‑
80℃保存；步骤2，染色：取步骤1得到的血清，加入染液，混合均匀，在37℃水浴条件下孵育15
‑
25min，之后进行离心，离心后取上清，得到染色后的血清；步骤3，凝胶管制备：取玻璃管固定在支架上，在玻璃管内加入分离胶，分离胶的胶层高度为71
‑
79mm，待凝胶表面聚合平整后，在玻璃管内加入浓缩胶，浓缩胶的胶层高度为6
‑
14mm，待凝胶表面聚合平整后，使用白炽灯光照30mim进行光聚合，得到凝胶管；步骤4，电泳：将步骤3制备得到的凝胶管垂直放入圆盘电泳槽，分别在正负极电泳槽内注入电泳缓冲液，将步骤2制备的染色后的血清缓慢加入凝胶管内，覆盖在分离胶的表面，接通稳压电源，电流为2
‑
10mA/管，时间为1.5
‑
2h。2.如权利要求1所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2中使用的染液为苏丹黑B染液。3.如权利要求2所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于：所述苏丹黑B染液的制备方法包括取0.25g苏丹黑B和25ml乙二醇混合，在50
‑
60℃加热5min，加热时不断搅拌，之后升温至100
‑
110℃，加热5min，趁热使用0.22um膜过滤，待冷却后，再用0.22um膜过滤一次，之后加入15ml蔗糖，混匀后避光保存。4.如权利要求1或2所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3中在加入分离胶之后缓慢注入100uL蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置30min以上，待凝胶聚合平整后去掉水层。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴瑶瑶，邓结飞，唐红艳，汪培，
申请(专利权)人：安徽佳创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：