一个肿瘤相关次生淋巴水肿的药物干预靶点及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个肿瘤相关次生淋巴水肿的药物干预靶点，该靶点是CLEC3B基因及其编码蛋白。本发明专利技术提供的基因在肿瘤相关次生淋巴水肿患者来源的脂肪干细胞中表达显著上调。siRNA介导的CLEC3B基因敲低可显著下调纤维化和TGF

【技术实现步骤摘要】
一个肿瘤相关次生淋巴水肿的药物干预靶点及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一个肿瘤相关次生淋巴水肿的药物干预靶点，及其在缓解脂肪组织病理性纤维化过程中的应用。

技术介绍

[0002]淋巴水肿一般指机体某些部位淋巴回流受阻或者功能障碍而导致的组织液在组织间累积的病理现象。次生淋巴水肿是最常见的形式，发生于肿瘤淋巴节清扫之后，即所谓的肿瘤相关次生淋巴水肿。有报道称高达20％的乳腺癌患者在治疗后会发生次生淋巴水肿。淋巴水肿一般表现为肢体皮下脂肪组织的进行性肿胀、脂肪组织的慢性炎症反应，脂肪组织病理性纤维化和过多的脂肪沉积等病理过程。淋巴水肿往往给肿瘤患者带来沉重的生理和心理负担，严重影响患者的生活质量。然而，目前仍旧缺乏有效的药物疗法对其进行干预和预防。
[0003]脂肪组织中包含多种细胞类型，例如脂肪干细胞(ADSC)、脂肪细胞、血管细胞和免疫细胞。所有的非脂肪细胞的集合被称作基质血管部分(SVF)。以往研究表明在次生淋巴水肿的病理状况下，SVF的细胞组成、细胞增殖和分化都发生了明显的改变，这种改变会加剧次生淋巴水肿的进展。因此通过对SVF的这些相应改变的研究，可以为次生淋巴水肿提供新的药物治疗靶点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种可用于治疗和缓解肿瘤相关次生淋巴水肿的药物干预靶点。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种药物干预靶点在治疗和缓解肿瘤相关次生淋巴水肿药物中的应用，所述药物干预靶点为CLEC3B基因及其编码蛋白。优选的，所述药物包括基因敲低技术对所述靶点基因CLEC3B或其编码蛋白的干预药物。
[0007]其中，所述基因CLEC3B编码一种跨膜钙离子结合蛋白，表达定位于脂肪来源干细胞的胞浆、胞外基质和外泌体中。
[0008]本专利技术提供证据表明在次生淋巴水肿患者的脂肪来源干细胞中CLEC3B基因发生了显著上调。
[0009]本专利技术所述基因敲低技术有三种，分别是shRNA，siRNA和CRISPR/Cas系统；shRNA和siRNA都是在RNA水平上降低蛋白的表达，CRISPR/Cas是在DNA水平上降低蛋白的表达；本专利技术基因敲低技术优选siRNA。
[0010]本专利技术提供证据表明对次生淋巴水肿患者的ADSC中CLEC3B基因进行siRNA介导的敲低，可显著下调纤维化和TGF
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β信号通路相关基因表达，进而缓解脂肪组织的病理性纤维化。所述纤维化相关基因包括COL1A、COL1A2、COL3A1、CCN2、FN1、SEPRINE1，所述TGF
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β信号通路相关基因包括TGFB1、SMAD3。
[0011]本专利技术提供了一种靶点基因在缓解脂肪组织纤维化药物中的应用，所述靶点基因是CLEC3B。针对CLEC3B基因及其编码蛋白产物而设计的siRNA药物、小分子抑制剂或抗体类用于治疗淋巴水肿的药物都包含在本专利技术的保护范围之内。
[0012]本专利技术的抑制淋巴水肿脂肪组织纤维化的药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：脂质体、稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
[0013]所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0014]所述药物可以单独施用；或者与其他能够抑制纤维化的药物进行组合施用。
[0015]有益效果
[0016]本专利技术公开了一个肿瘤相关次生淋巴水肿的药物干预靶点，该靶点是CLEC3B基因及其编码蛋白。本专利技术所述基因在肿瘤相关次生淋巴水肿患者来源的脂肪干细胞中表达显著上调。siRNA介导的CLEC3B基因敲低可显著下调纤维化和TGF
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β信号通路相关基因表达，因而可有效缓解淋巴水肿的脂肪组织纤维化。在此基础上，包括siRNA在内的针对该靶点设计的药物可用来治疗和缓解淋巴水肿。本专利技术为淋巴水肿的治疗提供了新的药物靶点。
附图说明
[0017]图1.CLEC3B基因在淋巴水肿患者的患侧肢体来源的ADSC中的表达显著高于健康侧肢体来源的ADSC。这里的表达量显示的是RNA
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seq结果；统计显著性阈值：Wilcoxon signed rank test P
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value＝0.008；n＝8。
[0018]图2.siRNA介导的CLEC3B基因敲低可以显著缓解淋巴水肿患者来源的ADSC的纤维化。A.实验示意图。B.RT
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PCR结果显示CLEC3B基因敲低可以显著降低淋巴水肿患者来源的ADSC的纤维化相关基因表达。统计显著性阈值：成对t检验P<0.05；n＝3。
具体实施方式
[0019]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0020]下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021]下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0022]实施例1
[0023]本实施例证明CLEC3B基因在淋巴水肿患者的ADSC中表达上调。
[0024]1、分离和培养ADSC
[0025]本研究所有样本来源于北京协和医院整形美容外科。本研究所有操作程序已经过北京协和医院伦理审查委员会批准，入组对象均已签署知情同意书。本专利技术共入组妇科肿瘤术后III期发生单侧腿部淋巴水肿患者11例。将从淋巴水肿患者患侧和健康侧大腿中分离的新鲜的脂肪组织，装至50ml的无菌离心管中，每管约10ml；每管加入10ml的HBSS溶液清洗2
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3次脂肪组织，后每管加入20ml的0.15％胶原酶Ⅰ+4％青霉素/链霉素双抗溶液在37℃消化30分钟。消化后的悬液加入10ml的HBSS溶液，1500转离心10分钟；后用HBSS溶液重悬细
胞沉淀，并用100um的滤网进行过滤；将过滤后的细胞悬液1500转离心10分钟，用低糖DMEM+10％FBS+1％P/S重悬细胞，培养于细胞培养皿中。原代细胞传代至第三代的细胞用于进一步实验。
[0026]2、RNA提取
[0027]使用Qiagen公司的miRNesay Mini Kit对ADSC细胞的总RNA进行提取。加入700ul QIAzol Lysis Reagent到细胞中，充分混合，室温下孵育5分钟；后加入140ul的氯仿，剧烈振荡15s，室温下孵育3分钟，4℃环境中，12000g离心15分钟。将离心后得到的水相转移到新管中，加入525ul的无水乙醇，混匀。吸出样本，加入到RNeasy Mini column中，室温下8000g离心15s，丢弃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种药物干预靶点在治疗和缓解肿瘤相关次生淋巴水肿药物中的应用，所述药物干预靶点为CLEC3B基因及其编码蛋白。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述次生淋巴水肿患者的CLEC3B基因相较于健康者显著上调，所述基因CLEC3B编码一种跨膜钙离子结合蛋白，表达定位于脂肪来源干细胞的胞浆、胞外基质和外泌体中。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括基因敲低技术对所述靶点基因CLEC3B或其编码蛋白的干预药物。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因敲低技术有三种，分别是shRNA，siRNA和CRISPR/Cas系统；shRNA和siRNA都是在RNA水平上降低蛋白的表达，CRISPR/Cas是在DNA水平上降低蛋白的表达。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因敲低技术为siRNA，所用靶向CLEC3B的siRNA为4个siRNA的混合，核苷酸序列信息如下：GAACUGCGCGGUCCUGUCA、GCGAUCAGCUGCCCUACAU、GAACGACGCCCUGUAUGAU、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宣雨，袁梦，向琴琴，陈文，李竹君，陈洁，黄久佐，俞楠泽，周洲，龙笑，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：