SmbZIP2基因在提高丹参中丹酚酸含量中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一条转录因子SmbZIP2在提高丹参丹酚酸含量中的应用。本发明专利技术从脱落酸诱导的丹参转录组数据库中筛选到全长1386bp的SmbZIP2基因。利用CRISPR

【技术实现步骤摘要】
SmbZIP2基因在提高丹参中丹酚酸含量中的应用


[0001]本专利技术涉及一条SmbZIP2基因，通过敲除SmbZIP2基因可以提高丹参中丹酚酸的含量，属于基因工程


技术介绍

[0002]丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科多年生草本植物，始载于《神农本草经》，《本草经疏》、《本草纲目》中亦有记载，作为一种传统中药在我国沿用已久。丹参被广泛应用于治疗心脑血管疾病、月经不调及各种炎症等，也因此被纳入《中华人民共和国药典》。目前市场上以丹参为原料生产的剂型包括注射剂、冲剂、糖浆剂、片剂等，其中包含复方丹参片、复方丹参滴丸、丹参注射液、丹参酮胶囊、冠心丹参片、丹参保心茶、丹参红花茶等上百种中成药。丹参中主要活性成分包含脂溶性的丹参酮类化合物及水溶性的酚酸类化合物。其中水溶性成分主要包含丹酚酸A,B,C及迷迭香酸，咖啡酸等。由于丹参植株生长周期长及丹参中丹酚酸含量较低，化学合成成本高的现象导致市场上丹酚酸供不应求的现状日益明显。如何提高丹参中丹酚酸含量已成为近些年的研究热点。
[0003]诱导子处理是提高丹参中次级代谢产物的有效策略。研究表明脱落酸(ABA)处理丹参毛状根，可促进丹参酮及丹酚酸的积累。以ABA诱导的丹参转录组为依据，从中筛选到一条强烈响应ABA的转录因子bZIP2。利用CRISPR
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Cas9策略，在丹参毛状根中敲除bZIP2基因，可显著促进丹酚酸的积累。目前尚未发现与本专利技术主题所提及的通过敲除SmbZIP2基因提高丹参中丹酚酸的方法的相关报道。因此，本专利技术在实际解决丹酚酸药源紧缺性的问题上具有积极意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的克服常规技术中的不足，提供了一条SmbZIP2基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用。
[0005]本专利技术综合应用转录组测序，载体构建、遗传转化、分子检测、定量PCR分析、靶点探究、化合物的提取及含量测定等手段。依据ABA诱导的丹参转录组库，从中筛选一条强烈响应ABA的SmbZIP2基因，其全长为1386bp，基因序列如SEQ ID NO.1所示。设计sgRNA序列，构建SmbZIP2基因的CRISPR
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Cas9表达载体；遗传转化丹参外植体获得成功敲除SmbZIP2基因的毛状根系；QRT
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PCR分析转基因丹参毛状根中SmbZIP2以及丹酚酸生物合成途径中的相关基因的表达；高效液相色谱法(HPLC)测定转基因丹参毛状根中丹酚酸的含量，发现敲除株系丹酚酸含量可达59.35mg/g DW，是对照组的1.53倍。利用基因工程手段研究SmbZIP2在丹酚酸生物合成中的调控作用，为丹酚酸代谢工程提供了重要的转录因子基因，为深入了解丹酚酸合成与调控提供了科学支持，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
[0006]其中，在丹参中敲除SmbZIP2基因具体包括如下步骤：
[0007](1)在SmbZIP2基因第一外显子区设计sgRNA序列；
[0008](2)将sgRNA序列构建于含有CRISPR
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Cas9表达框的中间载体上；
[0009](3)将含有sgRNA序列的CRISPR
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Cas9表达框构建到植物表达载体上；
[0010](4)将步骤(3)所得的敲除载体转入到发根农杆菌中；
[0011](5)利用步骤(4)所转化的发根农杆菌菌株遗传转化丹参外植体，所获得的毛状根经过PCR鉴定及测序确定敲除成功株系。
[0012]进一步地，所述步骤(1)中，根据G
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19base
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NGG原则在SmbZIP2基因第一外显子区设计sgRNA序列，其基因序列如SEQ ID NO.12所示。
[0013]进一步地，所述步骤(2)中，所用含有CRISPR
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Cas9表达框的中间载体为18T
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CRISPR
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Cas9，其含有EcoRI，HindIII酶切位点。
[0014]进一步地，所述步骤(3)中，植物表达载体为pCAMBIA2300。限制性内切酶EcoRI，HindIII双酶切pCAMBIA2300获得线性载体片段，将sgRNA
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CRISPR
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Cas9表达框插入，其中sgRNA
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CRISPR
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Cas9由AtU6启动子驱动表达。
[0015]进一步地，所述步骤(4)中，发根农杆菌菌株为C58C1。
[0016]进一步地，所述步骤(5)中，丹参无菌苗外植体的侵染和PCR检测方法如下：
[0017](5.1)预培养：将丹参无菌苗带有伤口的外植体平铺于1/2MS固体培养基上，黑暗放置2天；
[0018]共培养：将预培养的外植体与发根农杆菌共同混合进行侵染约10分钟，之后用无菌纸吸干表面菌液，置于1/2MS固体培养基黑暗培养2天；
[0019]降抗：将共培养的外植体放在含有羧苄青霉素的1/2MS固体培养基上，每隔两周降一次抗直至无抗；
[0020]分单克隆：将单克隆毛状根系剪下置于1/2MS固体培养基上；
[0021]继代：将单克隆剪下一部分用于继代。
[0022](5.2)设计发根农杆菌rolB基因的特异PCR引物，进行PCR扩增；
[0023](5.3)敲除成功株系鉴定：在SmbZIP2基因sgRNA序列上下游特异性引物，以基因组DNA为模板进行扩增。所扩增产物进行测序鉴定敲除成功的株系。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0025]1、显著提高丹参毛状根中丹酚酸的含量。
[0026]2、深度解析SmbZIP2在生物合成丹酚酸的调控机制。
[0027]3、专利技术方法效果可靠。
[0028]4、获取丹酚酸的成本低。
附图说明
[0029]图1转录组中筛选SmbZIP2基因。图A为ABA转录组数据库筛选，图B为组织转录组库筛选；
[0030]图2SmbZIP2基因进化分析及蛋白结构分析；
[0031]图3SmbZIP2基因抑制PAL的表达。图A为Dual
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LUC载体构建示意图，图B为Dual
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LUC结果图；图C为PAL启动子ABRE元件分析示意图；图D为酵母单杂交结果；
[0032]图4SmbZIP2蛋白亚细胞定位分析。YFP，黄色荧光蛋白；Bright field，明场；Merged，黄色荧光蛋白与明场的合并图；
[0033]图5SmbZIP2敲除毛状根的获得。图A为CRISPR
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Cas9载体构建示意图；图B为PCR鉴
定图；图C为定量PCR检测SmbZIP2基因的表达；图D为毛状根外观图；图E为测序峰图及突变位点图；
[0034]图6SmbZIP2敲除毛状根中丹酚酸合成途径关键基因的表达；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一条SmbZIP2基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种权利要求1所述SmbZIP2基因在提高丹参中丹酚酸含量中的应用，其特征在于，通过在丹参中敲除SmbZIP2基因来促进丹参毛状根产生丹酚酸。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述在丹参中敲除SmbZIP2基因具体包括如下步骤：(1)在SmbZIP2基因第一外显子区设计sgRNA序列；(2)将sgRNA序列构建于含有CRISPR
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Cas9表达框的中间载体上；(3)将含有sgRNA序列的CRISPR
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Cas9表达框构建到植物表达载体上；(4)将步骤(3)所得的敲除载体转入到发根农杆菌中；(5)利用步骤(4)所转化的发根农杆菌菌株遗传转化丹参外植体，所获得的毛状根经过PCR鉴定及测序确定敲除成功株系。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，根据G
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19base
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NGG原则在SmbZIP2基因第一外显子区设计sgRNA序列，其基因序列如SEQ ID NO.12所示。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，所用含有CRISPR
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Cas9表达框的中间载体为18T
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CRISPR
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Cas9，其含有EcoRI，HindI...

【专利技术属性】
技术研发人员：开国银，时敏，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：