ApoE基因缺失斑马鱼的制备制造技术

本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术，构建成了ApoE基因缺失斑马鱼，具体步骤包括：1)根据ApoE基因序列，确定ApoE靶位点；2)制备gRNA；3)体外转录Cas9mRNA；4)将Cas9mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；5)将F0胚胎饲养至性成熟；6)与野生型成鱼外交，筛选F0；7)选取可产生有效突变的F0自交，筛选F1；8)从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代；9)筛选ApoE基因敲除纯合子即为稳定遗传的ApoE基因缺失斑马鱼。本发明专利技术构建的ApoE基因缺失斑马鱼可稳定遗传，可用于阿尔兹海默症、骨质疏松、冠心病疾病的研究。冠心病疾病的研究。冠心病疾病的研究。

【技术实现步骤摘要】
ApoE基因缺失斑马鱼的制备


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及ApoE基因缺失斑马鱼的制备。

技术介绍

[0002]人的ApoE是一个由299个氨基酸组成的糖蛋白，在多种器官中表达，表达量最高的是肝脏，其次是大脑。大脑中表达ApoE的细胞主要是一些非神经元细胞，ApoE和Aβ相互作用，在阿尔兹海默症发病中扮演了重要角色。在周边和中枢神经系统中，神经元损伤后ApoE表达会大量增加，一些研究表明ApoE在维持神经的可塑性和功能方面十分重要。近年来，国内外学者认为ApoE是骨质疏松症的候选基因之一，ApoE基因多样性与骨量流失和骨质疏松性具有相关性。ApoE基因多态性与冠心病发生有密切关系，ApoE基因变异对冠心病的危险性有强烈而持续的影响。
[0003]斑马鱼性成熟时间短，出生后3个月就可以达到性成熟，繁殖能力强，饲养成本低，生命周期短，胚胎体外发育且透明，所需药物少，非常适宜用于阿尔兹海默症、骨质疏松、冠心病的研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是利用CRISPR/Cas9系统构建一种ApoE基因缺失斑马鱼。
[0005]本专利技术的制备过程如下：
[0006]本专利技术靶位点DNA序列为：5
’‑
GGATGGCGCCACCCAGAAAC
‑3’
。
[0007]本专利技术提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，其序列为5
’‑
GGATGGCGCCACCCAGAAACr/>‑3’
，5
’‑
AAACGTTTCTGGGTGGCGCCAT
‑3’
，使用该试剂盒可以用于ApoE基因表达的沉默。
[0008]本专利技术提供了一种基因敲除方法，所述方法的步骤如下：利用所述的Oligo片段识别目的基因的靶位点，与Cas9结合并识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行剪切，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。
[0009]进一步的，所述靶点为一个或以上。
[0010]进一步的，本专利技术提供ApoE基因缺失斑马鱼的制备方法，所述制备方法包括：
[0011]1.根据ApoE基因序列，确定ApoE靶位点；
[0012]2.根据ApoE靶位点，设计Oligo序列；
[0013]3.构建gRNA体外转录载体；
[0014]4.PCR获得gRNA体外转录模板；
[0015]5.对步骤4获得的模板进行体外转录，得到gRNA；
[0016]6.制备Cas9 mRNA的体外转录模板；
[0017]7.体外转录Cas9 mRNA；
[0018]8.添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；
[0019]9.将Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；
[0020]10.将F0胚胎饲养至性成熟；
[0021]11.与野生型成鱼外交，筛选F0；
[0022]12.选取可产生有效突变的F0自交，筛选F1；
[0023]13.从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代；
[0024]14.筛选ApoE基因敲除纯合子即为稳定遗传的ApoE基因缺失斑马鱼。
[0025]本专利技术的有益效果和优点在于：
[0026]本专利技术构建的ApoE基因缺失斑马鱼为国内外首例。
[0027]本专利技术构建的ApoE基因缺失斑马鱼可稳定遗传，可用于阿尔兹海默症、骨质疏松、冠心病疾病的研究。
附图说明
[0028]图1：克隆骨架pT7
‑
gRNA
‑
BbsⅠ电泳图
[0029]图2：菌液PCR鉴定
[0030]图3：gRNA体外转录模板
[0031]图4：体外转录Cas9 mRNA
[0032]图5：BbeⅠ酶切
[0033]图6：ApoE基因缺失斑马鱼与野生型序列对比
具体实施方式
[0034]下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本专利技术，并不限制本专利技术的范围。
[0035]实施例1：本专利技术动物模型的制备
[0036]1.实验动物
[0037]按标准化方案养殖野生型斑马鱼(TU品系)，水温28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h，成体斑马鱼产卵后收集胚胎，养殖于E3孵化液，以受精的小时数(hours post fertilization,hpf)或受精的天数(days post fertilization,dpf)表示胚胎和幼鱼的发育阶段。
[0038]2.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
[0039]在NCBI上查询斑马鱼ApoE基因序列，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx上设计ApoE靶位点，靶位点包含20个碱基，靶点的选择标准为：5
’‑
GG
‑
(N)18
‑
NGG
‑3’
；其中5
’
端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，靶位点3
’
端是NGG。
[0040]3.构建gRNA体外转录载体
[0041]3.1用BbsⅠ酶切pT7
‑
gRNA、切胶回收(见图1)，得到gRNA克隆骨架pT7
‑
gRNA
‑
BbsⅠ，酶切体系如下表1：
[0042]表1酶切体系：
[0043][0044]3.2根据靶位点订购两条oligo，oligo1序列为5
’‑
ATAGGATGGCGCCACCCAGAAACGT
‑3’
，oligo2序列为5
’‑
TAAAACGTTTCTGGGTGGCGCCTAT
‑3’
；
[0045]3.3用ddH2O分别将oligo溶解为10μM的溶液，退火，得到粘性末端小片段，退火程序见表2；
[0046]表2退火程序
[0047][0048]3.4将退火后的片段与回收的上述gRNA克隆骨架pT7
‑
gRNA
‑
BbsⅠ连接、转化，挑取克隆，用RV
‑
M与Oligo2作为引物进行菌液PCR鉴定(58℃退火，延伸30sec，30cycle)，目的条带约为130bp(见图2)，挑取阳性克隆送去测序，选取序列正确的克隆甘油保菌、提质粒，RV
‑
M序列：5
’‑
AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
‑3’
，连接体系见表3；
[0049]表3连接体系
[0050][0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ApoE基因缺失斑马鱼的制备，其特征在于，包括以下步骤：1)根据ApoE基因序列，确定ApoE靶位点；2)根据ApoE靶位点，设计Oligo序列；3)构建gRNA体外转录载体；4)PCR获得gRNA体外转录模板；5)对步骤4获得的模板进行体外转录，得到gRNA；6)制备Cas9 mRNA的体外转录模板；7)体外转录Cas9 mRNA；8)添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；9)将Cas9 mRNA和gRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪利平，
申请(专利权)人：汪利平，
类型：发明
国别省市：