一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，属于食品安全检测技术领域，以六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化铒、聚乙烯亚胺、氯化钠和氟化铵的乙二醇混合液为原料，制备上转换荧光纳米材料；通过戊二醛交联法将上转换材料与卡那霉素适配体连接起来；与卡那霉素适配体互补链

【技术实现步骤摘要】
一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法


[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体设计一种基于上转换荧光与BHQ3猝灭剂对食品中卡那霉素含量的检测方法。

技术介绍

[0002]卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，通过与30S核糖体结合从而致使mRNA密码误读,从而抑制蛋白质的合成。卡那霉素对某些微生物的生长和存活有很大的抑制作用，可以用来治疗有革兰氏革兰氏阳性菌和阴性菌引起的感染，被广泛用于食品生产和畜牧业。与此同时，卡那霉素的不合理使用会导致在肉类、牛奶和其他动物性食品中残留，然后通过食物链进入人体,可对人体产生极大的毒性，包括肾毒性、抗生素耐药性、神经肌肉阻滞作用和过敏反应等。为保护人类健康，欧盟规定牛奶中卡那霉素的最大允许残留量不超过150μg/kg,最近，中国颁布的标准是牛奶中卡那霉素的最大允许残留量不超过200μg/kg.传统的检测方法例如气相色谱，高效液相色谱法，液相色谱质谱联用法，酶联免疫法,毛细管电泳法等，虽然这些方法都是稳定可靠的，具有足够的精确性，但大多都存在耗时长，样品预处理繁琐，成本高等缺点，不能满足卡那霉素的实时快速检测要求。本专利技术提出了一种快速准确的卡那霉素检测方法，克服传统方法的不足，提高卡那霉素检测的灵敏度和准确性。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服现有检测技术中存在的不足，如：检测成本高、时间长、预处理和检测步骤繁琐等，本专利技术提供了一种食品中卡那霉素的上转换荧光检测方法，通过纳米可控自组装制备荧光供体，构建稳态特异性卡那霉素的检测体系，消除背景荧光、其他因素干扰的影响，实现食品中卡那霉素的低成本、高灵敏和特异性检测。
[0004]为实现以上目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0005]步骤一，上转换荧光纳米材料的制备：将稀土氯化物(六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化钬和六水氯化铒)氯化钠以及聚乙烯亚胺加入到乙二醇剧烈搅拌溶解；然后再次向混合液中加入含氟化铵的乙二醇溶液，剧烈搅拌至溶液均一透明；反应液转移至反应釜中密封加热；冷却后用乙醇和水的混合液对反应产物清洗，真空干燥得到上转换荧光纳米材料。
[0006]步骤二，荧光纳米探针的制备：将一步合成法得到的上转换荧光纳米材料溶解于缓冲溶液中，通过戊二醛交联法，将卡那霉素适配体与上转换荧光纳米材料连接起来。
[0007]步骤三，特异性检测体系的构建：将卡那霉素适配体与上转换材料的耦合物分散在缓冲液中，然后加入与卡那霉素适配体互补链连接的BHQ3溶液，孵育，通过碱基互补配对原则形成上转换/卡那霉素适配体/适配体互补链/BHQ3复合物。
[0008]步骤四，卡那霉素检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的卡那霉素溶液依次加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y，建立卡那霉素浓度
c与荧光强度信号特征值Y的关系，即得到卡那霉素检测标准曲线。
[0009]步骤五，牛奶中卡那霉素的检测：向牛奶样品中加入乙腈，沉淀蛋白之后，离心，去掉上层脂肪和下层沉淀，再用缓冲溶液稀释，加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过所构建的卡那霉素检测标准曲线，计算出食品样本中卡那霉素的含量。
[0010]步骤一中，所述六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化钆、六水氯化铒的用量比为0.53mmol：0.2mmol：0.25mmol：0.02mmol；所述聚乙烯亚胺和氯化钠的用量比为0.3g：0.15g；乙二醇的用量为15ml，所述搅拌溶解的时间为15min；氟化铵和乙二醇的用量比：0.18g：5mL；所述再次搅拌时间为20min；所述反应釜中反应条件为200℃反应12h。
[0011]步骤二中，所述上转换溶液与25％戊二醛的用量比为10ml：1.25ml；孵育时间为2h；加入的卡那霉素适配体的量为0.5OD，孵育时间为12h；缓冲液为PBS缓冲液，pH为7.4。
[0012]步骤三中，上转换适配体耦合物与BHQ3互补链用量比为10ml：0.8ml,所述BHQ3互补链浓度为1OD
·
ml
‑1，孵育时间为40min。
[0013]步骤四中，所述卡那霉素溶液的终浓度范围0.5
‑
50μM；特异性检测体系总体积为1ml；所述测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y，具体是测定980nm激发光激发下654nm处的荧光强度值；所述卡那霉素检测标准曲线，是指构建特异性检测体系的荧光强度信号特征值与卡那霉素浓度关系的标准曲线，即Y＝165.64c+12015，决定系数R2＝0.9847。
[0014]步骤五中，所述牛奶样品与乙腈的用量比1：1，所述离心转速为7000rpm，时间为10min；最终检测终体积为1ml；所述测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值是980nm激发光激发下654nm处的荧光强度值。
[0015]上述的上转换荧光与BHQ3猝灭剂对食品中卡那霉素含量的检测方法中，所述的卡那霉素适配体序列为：5'
‑
TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA
‑
3'，互补链序列为：5'
‑
TCGGCTTAGCCTCAACCCCCA
‑
3'。
[0016]与现有检测技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0017]1.本专利技术公开一种牛奶中卡那霉素的荧光检测方法，通过纳米可控自组装制备荧光供体，构建稳态特异性卡那霉素检测体系，消除背景荧光、蛋白质和脂肪等的干扰，实现牛奶中卡那霉素的低成本、高灵敏和快速特异性检测。
[0018]2.本专利技术构建的特异性混合检测体系，具体优化设计的适配体功能化上转换荧光纳米材料
‑
互补链BHQ3混合体系，对卡那霉素具有强的荧光响应性，可有效消除背景荧光及其他因素的干扰，对卡那霉素的检测具有特异性。
[0019]3.本专利技术建立的卡那霉素浓度与荧光强度信号特征值的线性浓度范围为0.05
‑
50μM，具有较宽的线性检测范围，检测限LOD为6nM，可以满足国标要求的牛奶中卡那霉素残留量检测。
附图说明
[0020]图1本专利技术制备的上转换荧光纳米材料的透射电镜图；
[0021]图2本专利技术不同卡那霉素浓度条件下检测体系的荧光信号；
[0022]图3本专利技术基于适配体功能化上转换与BHQ3互补链混合体系的卡那霉素检测标准曲线；
具体实施方式
[0023]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]下面结合说明书附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0025]实施例1：
[0026]步骤一，上转换荧光纳米材料的制备：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：上转换荧光纳米材料的制备；步骤二，荧光纳米探针的制备：将一步合成法得到的上转换荧光纳米材料溶解于缓冲溶液中，通过戊二醛交联法，将卡那霉素适配体与上转换荧光纳米材料连接起来；步骤三，特异性检测体系的构建：将卡那霉素适配体与上转换荧光纳米材料的耦合物分散在缓冲液中，然后加入与卡那霉素适配体互补链连接的BHQ3溶液，孵育，通过碱基互补配对原则形成上转换/卡那霉素适配体/适配体互补链/BHQ3复合物；步骤四，卡那霉素检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的卡那霉素溶液依次加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y，建立卡那霉素浓度c与荧光强度信号特征值Y的关系，即得到卡那霉素检测标准曲线；步骤五，牛奶中卡那霉素的检测：向牛奶样品中加入乙腈，沉淀蛋白之后，离心，去掉上层脂肪和下层沉淀，再用缓冲溶液稀释，加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过所构建的卡那霉素检测标准曲线，计算出牛奶中卡那霉素的含量。2.根据权利要求1所述的一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，步骤二中，所述上转换荧光纳米材料溶液浓度为1mg
·
ml
‑1；上转换荧光纳米材料溶液与25％戊二醛的用量比为10ml：1.25ml；孵育时间为2h。3.根据权利要求1所述的一种基于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张运莲，陈全胜，刘蕊，欧阳琴，李欢欢，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：